diskussion
agarosgelelektrofores har visat sig vara ett effektivt och effektivt sätt att separera nukleinsyror. Agaroses höga gelstyrka möjliggör hantering av låga procentuella geler för separation av stora DNA-fragment. Molekylär siktning bestäms av storleken på porerna som genereras av buntarna av agarose7 i gelmatrisen. I allmänhet, ju högre koncentrationen av agaros, desto mindre porstorleken., Traditionella agarosgeler är mest effektiva vid separation av DNA-fragment mellan 100 bp och 25 kb. För att separera DNA-fragment större än 25 kb måste man använda pulsfältsgelelektroforesis6, vilket innebär applicering av växelström från två olika riktningar. På detta sätt separeras större DNA-fragment av den hastighet vid vilken de omorienterar sig med förändringarna i nuvarande riktning. DNA-fragment mindre än 100 bp separeras mer effektivt med användning av polyakrylamidgelelektrofores., Till skillnad från agarosgeler bildas polyakrylamidgelmatrisen genom en fri radikal driven kemisk reaktion. Dessa tunnare geler har högre koncentration, körs vertikalt och har bättre upplösning. I modern DNA-sekvensering används kapillär elektrofores, varigenom kapillärrör fylls med en gelmatris. Användningen av kapillärrör möjliggör applicering av höga spänningar, vilket möjliggör separation av DNA-fragment (och bestämning av DNA-sekvens) snabbt.
Agaros kan modifieras för att skapa låg smältande agaros genom hydroxietylering., Låg smältande agaros används vanligtvis när isolering av separerade DNA-fragment önskas. Hydroxietylering minskar packningstätheten hos agarosbuntarna, vilket effektivt minskar deras porstorleks8. Detta innebär att ett DNA-fragment av samma storlek tar längre tid att röra sig genom en låg smältande agarosgel i motsats till en vanlig agarosgel. Eftersom buntarna associerar med varandra genom icke-kovalenta interaktioner9, är det möjligt att smälta en agarosgel igen efter att den har satt.
EtBr är det vanligaste reagenset som används för att färga DNA i agarosgelser10., Vid exponering för uv-ljus aktiveras elektroner i ethidiummolekylens aromatiska ring, vilket leder till utsläpp av energi (ljus) när elektronerna återgår till markläge. EtBr fungerar genom att interkala sig i DNA-molekylen på ett koncentrationsberoende sätt. Detta möjliggör en uppskattning av mängden DNA i något speciellt DNA-band baserat på dess intensitet. På grund av dess positiva laddning minskar användningen av EtBr DNA-migreringshastigheten med 15%. EtBr är en misstänkt mutagen och cancerframkallande, därför måste man vara försiktig när man hanterar agarosgeler som innehåller den., Dessutom betraktas EtBr som ett farligt avfall och måste bortskaffas på lämpligt sätt. Alternativa fläckar för DNA i agarosgeler inkluderar SYBR Gold, SYBR green, Crystal Violet och Methyl Blue. Av dessa behöver Metylblå och kristallviolett inte exponering av gelén för uv-ljus för visualisering av DNA-band, vilket minskar sannolikheten för mutation om återhämtning av DNA-fragmentet från gelén önskas. Men deras känslighet är lägre än EtBr., SYBR guld och SYBR green är båda mycket känsliga, uv-beroende färgämnen med lägre toxicitet än EtBr, men de är betydligt dyrare. Dessutom kan alla alternativa färgämnen antingen inte vara eller inte fungera bra när de läggs direkt till gelén, därför måste gelén vara postfärgad efter elektrofores. På grund av kostnad, användarvänlighet och känslighet är EtBr fortfarande det färgämne som valts för många forskare. I vissa situationer, t.ex. när farligt avfall är svårt eller när unga studenter utför ett experiment, kan dock ett mindre giftigt färgämne föredras.,
Laddningsfärger som används i gelelektrofores tjänar tre huvudändamål. Först lägger de densitet till provet, så att det kan sjunka in i gelén. För det andra ger färgämnena färg och förenklar laddningsprocessen. Slutligen rör sig färgämnena vid standardhastigheter genom gelén, vilket möjliggör uppskattning av avståndet som DNA-fragment har migrerat.
de exakta storlekarna av separerade DNA-fragment kan bestämmas genom att plotta loggen av molekylvikten för de olika banden av en DNA-standard mot det avstånd som varje band reste., DNA-standarden innehåller en blandning av DNA-fragment av förutbestämda storlekar som kan jämföras med de okända DNA-proverna. Det är viktigt att notera att olika former av DNA rör sig genom gelén i olika takt. Supercoiled plasmid DNA, på grund av sin kompakta konformation, rör sig genom gelén snabbaste, följt av ett linjärt DNA-fragment av samma storlek, med den öppna cirkulära formen som reser den långsammaste.,
Sammanfattningsvis, sedan antagandet av agarosgeler på 1970-talet för separation av DNA, har det visat sig vara en av de mest användbara och mångsidiga teknikerna inom biologisk vetenskapsforskning.