fenolföreningar
fenolföreningarna är bland de viktigaste druv-och vinbeståndsdelarna. De är ansvariga för alla skillnader i färg och smak mellan röda och vita viner. De representerar en varierande grupp av föreningar för vilka ett antal olika klassificeringssystem har tillämpats.,
vinfenoler brukar kallas ”polyfenoler”, som kan ses i Figur 2, på grund av närvaron av flera fenolgrupper i deras strukturer, vilket ger dessa föreningar olika egenskaper kopplade till hälsofördelar, särskilt de antioxidantegenskaper som tillskrivs konsumtionen av måttliga mängder rött vin. Mycket har publicerats om detta ämne och området och referenser till recensioner kan hittas i avsnittet ”Ytterligare läsning”.
Figur 2., Struktur av fenolföreningar. A) fenolsyror: i) derivat av O – och p-hydroxibensoesyra, ii) derivat av kanelsyra, B) flavonoider, C) antocyaniner och D) tanniner.
fenolsyrorna av vin (figur 2a) består huvudsakligen av derivat av bensoesyra och kanelsyra. Kanelsyrorna förestras i stor utsträckning med vinsyra (t.ex. kaffeoyltarvinsyra eller caftarinsyra) och de bildar också acylerade derivat av antocyaninmonoglykosider (se nedan)., Dessa föreningar spelar ingen viktig roll i vinets organoleptiska egenskaper, även om caftarsyra är mycket känslig för oxidation, vilket vrider musten eller vinbrun. Bakteriell verkan kan leda till omvandling av kannamsyraderivat (huvudsakligen p-kumarin-och ferulinsyror) till flyktiga fenoler som etylfenol, etylgaiacol eller vinyl gaiacol, som även i mindre mängder lånar intensivt obehagliga aromer och smak till vinet.
flavonoiderna (Figur 2B) är gulfärgade pigment som ger den blekgula färgen till vita viner., De är också närvarande i röda viner men deras färg maskeras av antocyaninerna (figur 2C), färgämnena i röda viner. Liksom antocyaninerna finns flavonoiderna främst som heterosider där 3-positionen på heterocykeln innehåller en sockerdel. Den senare kan i sin tur acyleras med kannamsyra, vilket ger större stabilitet på molekylen.
sockerdelen, som i vinantocyaniner vanligtvis är D-glukos, eller mer sällan l-rhamnos eller d-galaktos, uppträder huvudsakligen i 3-positionen., Malvidne-3-glukosid är överlägset den mest rikliga av antocyaninerna i vin som produceras av Vitis vinifera sorter. Det bör noteras att vissa hybrid arter av släktet Vitis (Vitis vinifiera×V berlanderi eller V rupestris) innehåller malvidne-3,5-diglucoside och dessa arter är inte tillåtet i viner som produceras i eller är avsedda för försäljning i Europeiska Unionen på grund av förhöjda halter av metanol som de producerar under vinframställningen., Identifiering av förekomsten av en sådan hybridsort i ett vin är genom bestämning av mängden malvidin-3,5-diglukosid, en analys som snabbt utförs genom tunnskiktskromatografi.
de tanniner som naturligt förekommer i vin är kända som kondenserade tanniner, polymera strukturer som härrör från polymerisation av elementära fenolföreningar, polyhydroxiflavan-3-ols som kallas katekinerna (figur 2D)., Beroende på konfigurationen av de kirala kolerna i positionerna 2 och 3 i heterocykeln är fyra olika stereoisomerer möjliga, ( + ) och (−) katekin och (+) och (−) epikatechin; (+) katekin och (−) epikatechin är de viktigaste byggstenarna av vin tanniner; dessa monomerer kondenserar snabbt för att bilda dimers, trimers, oligomerer och polymerer under vinframställning och vinåldring. De kondenserar också med antocyaniner, en process som under vinifieringen är viktig vid stabilisering av vinfärgen., Till skillnad från flavonolerna är pyranringen av flavan-3-ols mättad och icke–planar och så har dessa föreningar en maximal UV-synlig absorbansen vid 280 nm, i motsats till 370 och 520 nm för flavonoiderna respektive antocyaninerna.
de metoder som används för bestämning av vinfenolföreningar är mycket varierande, med tanke på deras struktur, polaritet, hydrofobicitet och UV-och synliga ljusabsorptionsegenskaper. Det är möjligt att samtidigt separera majoriteten av de huvudsakliga icke-polymeriserade vinfenolföreningarna med HPLC eller CE., I fallet med den förra används en omvänd faskolonn, vanligtvis oktadecylkol (C18). Om analysen ska omfatta separationer av antocyaninerna kräver den vattenhaltiga komponenten i den mobila fasen ett pH på <2 (pH-värden så låga som 1,5 har använts); antingen myrsyra eller ättiksyra eller en kombination av båda i koncentrationer som sträcker sig från 2% till 10% används för detta ändamål. Över pH 2 är den kraftiga toppbredningen resultatet av den långsamma omvandlingen mellan de olika antocyaninarterna, vilket leder till dålig upplösning och dåliga detektionsgränser., Dessutom är de spektrala egenskaperna hos antocyaninerna dåliga vid pH-värden som är större än 2 på grund av omvandlingen av flavyliumkatyren till färglös karbinol pseudobasform (Figur 3). Detta innebär att kromatografiska kolumner som är särskilt utformade för att motstå extrema pH-värden rekommenderas för denna analys. dessutom minimeras topptailing på grund av interaktion mellan hydroxylgrupperna i polyfenoler och oreagerade silanolgrupper på kiseldioxidytan genom att använda basavaktiverade kolumner., Den organiska komponenten i den mobila fasen är vanligtvis acetonitril, även om metanol ibland används. För att uppnå tillfredsställande separation av föreningar av sådana olika polariteter krävs utarbetade binära eller till och med ternära gradienter. Analystiden varierar från 50 till 120 min beroende på de exakta driftsförhållandena och graden av separation som krävs., Med en kombination av väl valda gradient och UV–synlig fotodiod array detektion, är det möjligt att samtidigt analysera tannin monomerer, dimers och trimers (λmax 280 nm), fenolsyror (λmax 330 nm), flavonoider (λmax 370 nm), och antocyaniner (λmax 525 nm) i en enda körning. Närvaron av olika kombinationer av dessa föreningar, i varierande koncentrationer, i kombination med otillgängligheten av många av standarderna gör det dock ganska svårt att tolka kromatogrammen., Delvis av denna anledning används masspektrometri allt oftare som en detekteringsmetod för polyfenolanalys – atmosfärstryckjoniseringstekniker tenderar att vara den mest använda.
Figur 3. Olika former av antocyaniner.
CE används inte lika mycket som LC för analys av vinpolyfenoler., När det gäller CE-UV-analys av antocyaninerna måste separationer utföras vid mycket sura pHs (på grund av de dåliga spektrala egenskaperna hos dessa föreningar vid neutrala eller grundläggande pH-värden) och detta medför problem när det gäller metodens selektivitet. CE är å andra sidan bättre lämpad för den icke-antocyaninfraktionen av vinpolyfenoler.
som tidigare beskrivits finns en viss fraktion av vinpolyfenolerna i kondenserade former (tannin–tannin, antocyanin–antocyanin, tannin–antocyanin), denna fraktion varierar med vinifieringsförhållandena och ökar med vinets ålder., Av denna anledning förblir ovanstående separationstekniker relativt begränsade för analys av polyfenoler, eftersom endast elementära icke-polymeriserade molekyler, som spelar en relativt liten roll i polyfenolernas övergripande egenskaper, kan bestämmas. För att analysera den kondenserade eller polymeriserade fraktionen med en av dessa separationstekniker är det nödvändigt att utföra en tiolys i förväg.,
med undantag för specifika tillämpningar kan kraven på rutinmässig polyfenolanalys uppfyllas på ett adekvat sätt genom tillämpning av ett antal tester som snabbt utförs utan att det behövs utarbetade instrument. Det är svårt att bestämma eller uttrycka resultaten när det gäller koncentration, så därför används olika index som representerar antingen totala polyfenoler eller olika grupper av polyfenolföreningar., De tester som beskrivs nedan är användbara för att följa utvecklingen av en vinframställning, för att göra jämförelser mellan olika viner och för att kvantifiera vissa organoleptiska egenskaper hos viner (särskilt bitterhet och astringency).
det totala polyfenolindexet erhålls genom utspädning av vinet och mätning av dess absorbans vid 280 nm. Indexet anges som absorbansen multiplicerad med utspädningsfaktorn (100 för röda viner)., Detta test tar inte hänsyn till de färglösa kalkonformerna av antocyaniner (Figur 3) eller fenolsyrorna som absorberar vid 230 nm, även om dessa föreningar är närvarande i så små mängder att de bidrar lite till det totala polyfenolinnehållet.
manganatindexet är baserat på minskningen av kaliumpermanganat med polyfenoler med hjälp av indikatorn carmino indigo, vars färg varierar mellan blått och gult enligt dess oxidationstillstånd., Den korrekta slutpunkten-när polyfenolerna oxideras men inte sockerarterna-är svår att identifiera, och vidare är metodens Reproducerbarhet dålig mellan operatörerna.,ines according to their permanganate index (milliequivalents of permanganate used in the titration) as follows:
| Red press wine | 100–150 |
| Tannic red wine | 75 |
| Soft red wine | 60 |
| Rosé wine | 27–35 |
| White wine | 1–15 |
The Folin–Ciocalteu (F–C) index is a more reliable indicator of polyphenol content and is extensively used., Reaktionsblandningen består av fosfotungstiska och fosfomolybidinsyror, vilka i alkaliskt medium reduceras av polyfenoler till en blandning av blåoxider av volfram och molybden, vars absorbansen läses vid 750 nm. F-C-indexet uttrycks som 100 gånger provets absorbansen; typiska värden ligger i området 25-35.
det finns antal kemiska metoder för bestämning av det totala antocyanininnehållet i ett vin, det enklaste är variationer i färgen på ett vin som en funktion av pH., Vid mycket surt pH är antocyaniner i sin flaviniumkatjonform, medan karbinol pseudobas bildas under mildt sura förhållanden (Figur 3). Absorbansen av vinet läses vid pH 0.6 och vid pH 3.5 och skillnaden i absorbansen har empiriskt visat sig korrelera med antocyaninkoncentrationen. Antocyanin bestämning med hjälp av skillnaden i absorbansen före och efter tillsatsen av en känd mängd svaveldioxid är baserad på samma princip.,
det är också möjligt att fraktionera vinantocyaniner på grundval av deras polymeriseringsgrad på en handförpackad kolonn bestående av polyvinylpolypyrrolidon, kiselgel g och kiseldioxid 60. De fria antocyaninerna eluerar i den första fraktionen (metanol–HCl 999:1), något polymeriserade antocyaniner i den andra fraktionen (myrsyra–vatten 1:1) och de kondenserade polymera formerna elueras i 100% myrsyra., Absorbansen för de tre fraktionerna läses spektrofotometriskt (538 nm för den första fraktionen och 525 nm för den andra och tredje fraktionen) och deras relativa proportioner kan således beräknas. Detta test är en mycket bra indikator på vinets ålder: ju yngre vinet desto högre absorbansen för den första fraktionen på grund av närvaron av antocyaninmonomerer; omvänt kommer absorbansen för den tredje (polymeriserade) fraktionen att vara störst hos äldre viner.,
kvantifiering av total tanninkoncentration utförs fortfarande med metoder baserade på den klassiska Bate–Smith-reaktionen: uppvärmning i starkt surt medium leder till bildandet av karbokationer, vilket i ett oxidantmedium bildar cyanidin (en antocyanin). Reaktionsblandningen blir sålunda röd (därav det gamla namnet för tanninerna – proanthocyanidinerna) och dess absorbansen läses vid 550 nm. Senare förbättringar av den ursprungliga 1954-metoden ledde till införlivandet av ytterligare åtgärder i tekniken., Olika empiriskt härledda beräkningar baserade på absorbansen vid 470, 520, 550 och 570 nm kan ge ett rimligt noggrant mått på vinets totala tanninhalt. Dessa mätningar skiljer emellertid inte mellan tanninmonomerer, oligomerer eller polymerer. Tanniner ger en känsla av bitterhet eller astringency på gommen på grund av deras interaktion med prolinrika proteiner och glykoproteiner i saliv., Tanninmolekylerna som är mest aktiva i detta avseende är de vars molekylmassa är mellan 600 och 3500; tanniner med större molekylmassa är för besvärliga för att komma åt proteins aktiva ställen, och detta förklarar varför under vinåldring, eftersom tanniner blir mer polymeriserade sinsemellan eller med antocyaniner, verkar de mindre aggressiva mot gommen. Så småningom leder denna polymerisation till molekyler som är tillräckligt stora för att fälla ut och förklarar depositionen som ofta ses i gamla viner., Denna princip för reaktionen mellan tanniner och proteiner utgör grunden för ett test, känt som gelatinindexet, för graden av astringency hos ett vin. En specificerad volym vin blandas med en lösning av gelatin (MM 5000-30000) och får reagera i 3 dagar och centrifugeras. Tanninkoncentrationen av vinet före och efter reaktion med gelatin bestäms som beskrivits ovan, och indexet uttrycks i termer av procentuell skillnad. Ju högre gelatinindex desto större är koncentrationen av ”astringent” tanniner i vinet., Detta test korrelerar ganska bra med graden av astringency som uppfattas av expertprovare.