skapad av Monica Z. Bruckner
Vad är Gram Staining?
Gram färgning är en vanlig teknik som används för att differentiera två stora grupper av bakterier baserat på deras olika cellväggskomponenter. Gramfläckningsproceduren skiljer mellan grampositiva och gramnegativa grupper genom att färga dessa celler rött eller violett., Grampositiva bakterier fläckar violett på grund av närvaron av ett tjockt lager av peptidoglykan i sina cellväggar, som behåller kristallvioletten dessa celler färgas med. Alternativt gramnegativa bakterier fläckar rött, vilket tillskrivs en tunnare peptidoglykanvägg, som inte behåller kristallvioletten under avfärgningsprocessen.
Hur fungerar Gram-färgning?
Gram färgning innebär tre processer: färgning med ett vattenlösligt färgämne som kallas kristallviolett, avfärgning och motfärgning, vanligtvis med safanin., På grund av skillnader i tjockleken hos ett peptidoglykanskikt i cellmembranet mellan grampositiva och gramnegativa bakterier behåller grampositiva bakterier (med ett tjockare peptidoglykanskikt) kristallviolett fläck under avkoloriseringsprocessen, medan gramnegativa bakterier förlorar kristallviolettfläcken och färgas istället av safranin i den slutliga färgningsprocessen. Processen innebär tre steg:
- celler färgas med kristallviolett färgämne., Därefter tillsätts en grams jodlösning (jod och kaliumjodid) för att bilda ett komplex mellan kristallviolett och jod. Detta komplex är en större molekyl än den ursprungliga kristallvioletta fläcken och jod och är olöslig i vatten.
- ett avfärgningsmedel som etylalkohol eller aceton tillsätts till provet, vilket dehydrerar peptidoglykanskiktet, krymper och stramar det. Det stora kristallviolettjodkomplexet kan inte penetrera detta åtdragna peptidoglykanlager och är sålunda fångat i cellen i Gram-positiva bakterier., Omvänt bryts det yttre membranet av gramnegativa bakterier och det tunnare peptidoglykanskiktet av gramnegativa celler kan inte behålla kristallviolettjodkomplexet och färgen förloras.
- ett motverk, såsom det svagt vattenlösliga safranin, läggs till provet och färgar det rött. Eftersom safranin är lättare än kristallviolett, stör det inte den lila färgen i Gram-positiva celler. De avkoloriserade gramnegativa cellerna är emellertid färgade röda.,
hur – färgning protokoll och oro:
reagenser:
- kristallviolett (primär fläck)
- jodlösning/grams jod (mordant som fixar kristallviolett till cellvägg)
- Avkoloriserare (t.ex. etanol)
- Safranin (sekundär fläck)
- vatten (helst i en sprutflaska)
- gör en bild av cellprov som ska färgas. Värm fixa provet till glid genom att försiktigt passera gliden med en droppe eller liten bit prov på den genom en bunsenbrännare tre gånger.,
- lägg den primära fläcken (kristallviolett) till provet / bilden och inkubera i 1 minut. Skölj slide med en mild ström av vatten i högst 5 sekunder för att ta bort obundet kristall violett.
- tillsätt grams jod i 1 minut – det här är en mordant eller ett medel som fixar kristallvioletten till bakteriecellväggen.
- skölj provet / skjut med aceton eller alkohol i ~3 sekunder och skölj med en mild ström av vatten. Alkoholen kommer att avfärga provet om det är Gram negativt, ta bort kristallvioletten., Men om alkoholen förblir på provet för länge kan det också avfärga Gram-positiva celler.
- lägg den sekundära fläcken, safranin, till bilden och inkubera i 1 minut. Tvätta med en mild ström av vatten i högst 5 sekunder. Om bakterierna är Gram-positiva, kommer det att behålla den primära fläcken (kristallviolett) och inte ta den sekundära fläcken (safranin), vilket gör att den ser violett/lila under ett mikroskop. Om bakterierna är gramnegativa, kommer det att förlora den primära fläcken och ta den sekundära fläcken, vilket gör att den visas röd när den ses under ett mikroskop.,