discussie
Agarosegelelektroforese is een efficiënte en effectieve manier gebleken om nucleïnezuren te scheiden. De hoge gelsterkte van Agarose staat voor de behandeling van lage percentagegels voor de scheiding van grote fragmenten van DNA toe. Het moleculaire zeven wordt bepaald door de grootte van poriën die door de bundels van agarose7 in de gelmatrix worden gegenereerd. In het algemeen, hoe hoger de concentratie van agarose, hoe kleiner de poriegrootte., Traditionele agarose-gels zijn het meest effectief bij de scheiding van DNA-fragmenten tussen 100 bp en 25 kb. Om fragmenten van DNA groter dan 25 kb te scheiden, zal men het gelelektroforese van het impulsveld moeten gebruiken 6, die de toepassing van wisselstroom uit twee verschillende richtingen impliceert. Op deze manier worden de grotere de fragmenten van DNA gescheiden door de snelheid waarmee zij zich met de veranderingen in huidige richting heroriënteren. De fragmenten van DNA kleiner dan 100 bp worden effectiever gescheiden gebruikend de elektroforese van het polyacrylamidegel., In tegenstelling tot agarose gels, wordt de polyacrylamidegelmatrix gevormd door een door vrije radicalen gedreven chemische reactie. Deze dunnere gels zijn van hogere concentratie, worden verticaal uitgevoerd en hebben een betere resolutie. In het moderne DNA wordt het rangschikken van capillaire elektroforese gebruikt, waarbij capillaire buizen met een gelmatrijs worden gevuld. Het gebruik van capillaire buizen staat voor de toepassing van hoge spanningen toe, waardoor de scheiding van fragmenten van DNA (en de bepaling van de opeenvolging van DNA) snel wordt toegestaan.
Agarose kan worden gewijzigd om laag smeltende agarose te creëren door hydroxyethylering., Het lage smelten agarose wordt over het algemeen gebruikt wanneer de isolatie van gescheiden fragmenten van DNA wordt gewenst. Hydroxyethylation vermindert de verpakkingsdichtheid van de agarosebundels, effectief verminderend hun poriegrootte 8. Dit betekent dat een fragment van DNA van dezelfde grootte langer zal duren om zich door een laag smeltend agarose-gel in tegenstelling tot een standaard agarose-gel te bewegen. Omdat de bundels met elkaar associëren door niet-covalente interacties9, is het mogelijk om een agarose-gel opnieuw te smelten nadat het is geplaatst.
EtBr is het meest voorkomende reagens dat wordt gebruikt om DNA in agarose gels te bevlekken10., Wanneer blootgesteld aan uv-licht, worden de elektronen in de aromatische ring van het ethidium molecuul geactiveerd, die tot de versie van energie (licht) leidt aangezien de elektronen aan grondstaat terugkeren. EtBr werkt door zichzelf in het DNA-molecuul op een concentratieafhankelijke manier te intercalaliseren. Dit staat voor een schatting van de hoeveelheid DNA in om het even welke bepaalde band van DNA toe die op zijn intensiteit wordt gebaseerd. Wegens zijn positieve Last, vermindert het gebruik van EtBr de migratie van DNA met 15%. EtBr is een verdacht mutageen en carcinogeen agens, daarom moet men voorzichtig zijn bij het omgaan met agarose gels die het bevatten., Bovendien wordt EtBr als gevaarlijk afval beschouwd en moet het op passende wijze worden verwijderd. Alternatieve vlekken voor DNA in agarose gels zijn SYBR Gold, SYBR green, Crystal Violet en Methyl Blue. Van deze, vereisen Methylblauw en Kristalviolet geen blootstelling van het gel aan uv-licht voor visualisatie van de banden van DNA, waardoor de waarschijnlijkheid van verandering wordt verminderd als de terugwinning van het fragment van DNA van het gel wordt gewenst. Hun gevoeligheden zijn echter lager dan die van EtBr., SYBR gold en SYBR green zijn beide zeer gevoelige, UV-afhankelijke kleurstoffen met een lagere toxiciteit dan EtBr, maar ze zijn aanzienlijk duurder. Bovendien kunnen alle alternatieve kleurstoffen niet of werken niet goed wanneer rechtstreeks aan het gel toegevoegd, daarom zal het gel post gekleurd na elektroforese moeten zijn. Vanwege de kosten, het gebruiksgemak en de gevoeligheid blijft EtBr nog steeds de kleurstof bij uitstek voor veel onderzoekers. In bepaalde situaties, zoals wanneer de verwijdering van gevaarlijk afval moeilijk is of wanneer jonge studenten een experiment uitvoeren, kan echter de voorkeur worden gegeven aan een minder giftige kleurstof.,
Belastingkleurstoffen die in gelelektroforese worden gebruikt, dienen drie belangrijke doeleinden. Eerst voegen ze dichtheid toe aan het monster, waardoor het in het gel kan zinken. Ten tweede bieden de kleurstoffen kleur en vereenvoudigen het laadproces. Tenslotte, bewegen de kleurstoffen zich bij standaardtarieven door het gel, die voor de schatting van de afstand toestaan dat de fragmenten van DNA zijn gemigreerd.
de exacte grootte van gescheiden DNA-fragmenten kan worden bepaald door de log van het molecuulgewicht voor de verschillende banden van een DNA-standaard uit te zetten tegen de afstand die door elke band wordt afgelegd., De standaard van DNA bevat een mengsel van fragmenten van DNA van vooraf bepaalde grootte die tegen de onbekende steekproeven van DNA kunnen worden vergeleken. Het is belangrijk op te merken dat de verschillende vormen van DNA zich door het gel met verschillende tarieven bewegen. Supercoiled plasmide DNA, wegens zijn compacte bouw, beweegt door het gel snelst, gevolgd door een lineair fragment van DNA van dezelfde grootte, met de open cirkelvorm die het langzaamste reizen.,
concluderend kan worden gesteld dat sinds de invoering van agarose gels in de jaren zeventig voor de scheiding van DNA, het een van de meest bruikbare en veelzijdige technieken in het biologisch wetenschappelijk onderzoek is gebleken.