fenolverbindingen
De fenolverbindingen behoren tot de belangrijkste bestanddelen van druiven en wijn. Zij zijn verantwoordelijk voor alle verschillen in kleur en smaak tussen rode en witte wijnen. Zij vertegenwoordigen een diverse groep verbindingen waarvoor een aantal verschillende classificatiesystemen zijn toegepast.,
Wijnfenolen worden gewoonlijk “polyfenolen” genoemd, wat te wijten is aan de aanwezigheid van meerdere fenolische groepen in hun structuren, die aan deze verbindingen verschillende eigenschappen verlenen die verband houden met gezondheidsvoordelen, met name de antioxiderende eigenschappen die worden toegeschreven aan de consumptie van matige hoeveelheden rode wijn. Er is veel over dit onderwerp gepubliceerd en het gebied en verwijzingen naar reviews zijn te vinden in het gedeelte “verder lezen”.
Figuur 2., Structuur van fenolverbindingen. A) fenolzuren: I) derivaten van o – en P-hydroxybenzoëzuur, ii) derivaten van kaneelzuur, B) flavonoïden, C) anthocyanen en D) tannines.
De fenolzuren van wijn (figuur 2A) bestaan voornamelijk uit derivaten van benzoëzuur en kaneelzuur. De kaneelzuren worden uitgebreid veresterd met wijnsteenzuur (bijvoorbeeld cafeoyltartaarzuur of kaftaarzuur) en ze vormen ook geacetyleerde derivaten van anthocyanine monoglycosiden (zie hieronder)., Deze verbindingen spelen geen belangrijke rol in de organoleptische eigenschappen van wijn, hoewel kaftaarzuur zeer gevoelig is voor oxidatie, waardoor de most of de wijn bruin wordt. Bacteriële werking kan leiden tot de omzetting van kaneelzuurderivaten (voornamelijk p-cumarinezuur en ferulinezuur) in vluchtige fenolen zoals ethylfenol, ethyl gaiacol of vinyl gaiacol, die zelfs in kleine hoeveelheden intens onaangename aroma ‘ s en smaak aan de wijn geven.
de flavonoïden (figuur 2B) zijn geelgekleurde pigmenten die de lichtgele kleur geven aan witte wijnen., Ze zijn ook aanwezig in rode wijnen, maar hun kleur wordt gemaskeerd door de anthocyanen (figuur 2C), de kleurstoffen van rode wijnen. Net als de anthocyanen, bestaan de flavonoïden voornamelijk als heterosiden waar de 3-positie op de heterocycle een suikerdeel bevat. Laatstgenoemden kunnen beurtelings met cinnamic zuur worden geacetyleerd, dat grotere stabiliteit op de molecule verleent.
De suikergroep, die in wijnanthocyanen gewoonlijk d-glucose is, of in zeldzame gevallen l-rhamnose of d-galactose, komt hoofdzakelijk in de 3-positie voor., Malvidne-3-glucoside is veruit de meest voorkomende anthocyanen in wijn geproduceerd uit Vitis vinifera variëteiten. Er zij op gewezen dat bepaalde hybride Vitis-soorten (Vitis vinifiera×V berlanderi of V rupestris) malvidne-3,5-diglucoside bevatten en dat deze soorten niet zijn toegestaan in wijnen die in de Europese Unie worden geproduceerd of bestemd zijn voor de verkoop, omdat zij tijdens de vinificatie een hoog methanolgehalte hebben., De aanwezigheid van een dergelijk hybride ras in een wijn wordt vastgesteld door de hoeveelheid malvidine-3,5-diglucoside te bepalen, een analyse die snel wordt uitgevoerd met behulp van dunnelaagchromatografie.
de tannines die van nature in wijn voorkomen worden gecondenseerde tannines genoemd, polymere structuren die ontstaan door de polymerisatie van elementaire fenolverbindingen, polyhydroxyflavan-3-ols, de catechines genoemd (figuur 2D)., Afhankelijk van de configuratie van de chirale koolstoffen in posities 2 en 3 van de heterocycle zijn vier verschillende stereoisomeren mogelijk, ( + ) en (−) catechine en (+) en (−) epicatechine; (+) catechine en (−) epicatechine zijn de belangrijkste bouwstenen van wijntannines; deze monomeren condenseren snel om dimeren, trimers, oligomeren en polymeren te vormen tijdens de vinificatie en wijnveroudering. Ze condenseren ook met anthocyanen, een proces dat tijdens de vinificatie belangrijk is voor de stabilisatie van de wijnkleur., In tegenstelling tot de flavonolen is de pyranring van de flavan-3-ols verzadigd en niet planair en dus hebben deze verbindingen een maximale UV–zichtbare absorptie bij 280 nm, in tegenstelling tot 370 370 en 520 nm voor respectievelijk de flavonoïden en de anthocyanen.
de methoden die worden gebruikt voor de bepaling van fenolhoudende wijnverbindingen zijn zeer gevarieerd, gezien de uiteenlopende aard van hun structuur, polariteit, hydrofobiciteit en absorptiekenmerken voor UV en zichtbaar licht. Het is mogelijk om de meerderheid van de belangrijkste niet-gepolymeriseerde fenolverbindingen van wijn gelijktijdig door HPLC of CE te scheiden., In het geval van de eerste wordt een omgekeerde-fasekolom gebruikt, gewoonlijk octadecylkoolstof (C18). Indien de analyse scheidingen van de anthocyanen omvat, vereist het waterige bestanddeel van de mobiele fase een pH van <2 (pH-waarden van slechts 1,5 zijn gebruikt); hiervoor worden ofwel mierenzuur of azijnzuur ofwel een combinatie van beide in concentraties van 2 tot 10% gebruikt. Boven pH 2 is een ernstige piekverbreding het gevolg van de langzame interconversie tussen de verschillende anthocyaninesoorten, wat leidt tot een slechte resolutie en slechte detectielimieten., Bovendien zijn de spectrale eigenschappen van de anthocyanen slecht bij pH-waarden hoger dan 2 als gevolg van de omzetting van het flavyliumkation in kleurloze carbinol pseudobase vorm (figuur 3). Dit betekent dat chromatografische kolommen die speciaal zijn ontworpen om extreme pH-waarden te weerstaan, worden aanbevolen voor deze analyse; bovendien wordt piekaftailing als gevolg van interactie tussen de hydroxylgroepen van de polyfenolen en niet-gereageerde silanolgroepen op het siliciumoppervlak geminimaliseerd door gebruik te maken van base-gedeactiveerde kolommen., De organische component van de mobiele fase is meestal acetonitril, hoewel methanol af en toe wordt gebruikt. Om een bevredigende scheiding van verbindingen van dergelijke diverse polariteiten te bereiken, zijn uitgebreide binaire of zelfs ternaire gradiënten vereist. De analysetijd varieert van 50 tot 120 min, afhankelijk van de exacte bedrijfsomstandigheden en de vereiste scheidingsgraad., Met een combinatie van verstandig gekozen gradiënt en uv–Zichtbare fotodiode array detectie, is het mogelijk om tegelijkertijd tannine monomeren, dimeren en trimers (λmax 280 nm), fenolzuren (λmax 330 nm), flavonoïden (λmax 370 nm) en anthocyanen (λmax ≈525 nm) in een enkele run te analyseren. Nochtans, maakt de aanwezigheid van diverse combinaties van deze samenstellingen, in variërende concentraties, in combinatie met de onbeschikbaarheid van veel van de normen interpretatie van de chromatogrammen vrij moeilijk., Gedeeltelijk om deze reden, wordt de massaspectrometrie meer en meer vaak gebruikt als opsporingsmethode voor polyfenolanalyse – de technieken van de atmosferische druk-ionisatie neigen om wijdst aangewend te zijn.
Figuur 3. Verschillende vormen van anthocyanen.
CE wordt niet zo veel gebruikt als LC voor de analyse van wijnpolyfenolen., Wat de CE-UV-Analyse van de anthocyanen betreft, moeten scheidingen worden uitgevoerd bij zeer zure pHs (vanwege de slechte spectrale eigenschappen van deze verbindingen bij neutrale of basische pH-waarden) en dit levert problemen op in termen van selectiviteit van de methode. CE is daarentegen beter geschikt voor de niet-anthocyaanfractie van wijnpolyfenolen.
zoals eerder aangegeven, bestaat een bepaalde fractie van de wijnpolyfenolen in gecondenseerde vormen (tannine–tannine, anthocyanine–anthocyanine, tannine–anthocyanine), deze fractie varieert met de vinificatieomstandigheden en neemt toe met de leeftijd van de wijn., Om deze reden, blijven de bovengenoemde scheidingstechnieken vrij beperkt voor de analyse van polyfenolen aangezien slechts elementaire niet-polymerized molecules, die een vrij kleine rol in de algemene eigenschappen van de polyfenolen spelen, kunnen worden bepaald. Om de gecondenseerde of gepolymeriseerde fractie met een van deze scheidingstechnieken te analyseren is het noodzakelijk vooraf een thiolyse uit te voeren.,
behalve voor specifieke toepassingen kan voldoende worden voldaan aan de eisen voor routinematige polyfenolanalyse door de toepassing van een aantal tests die snel worden uitgevoerd zonder de noodzaak van uitgebreide instrumenten. Het is moeilijk om de resultaten in termen van concentratie te bepalen of uit te drukken, dus daarom worden verschillende indices gebruikt die ofwel totale polyfenolen of verschillende groepen polyfenolen vertegenwoordigen., De hieronder kort beschreven proeven zijn nuttig voor het volgen van het verloop van een vinificatie, voor het maken van vergelijkingen tussen verschillende wijnen en voor het kwantificeren van bepaalde organoleptische eigenschappen van wijnen (met name bitterheid en verbittering).
de totale polyfenolindex wordt verkregen door de wijn te verdunnen en de absorptie bij 280 nm te meten. De index wordt gegeven als de extinctie vermenigvuldigd met de verdunningsfactor (100 voor rode wijn)., Bij deze test wordt geen rekening gehouden met de kleurloze chalconvormen van anthocyanen (Figuur 3), noch met de fenolzuren die bij 230 nm absorberen, hoewel deze verbindingen in zulke kleine hoeveelheden aanwezig zijn dat ze weinig bijdragen aan het totale polyfenolgehalte.
De permanganaatindex is gebaseerd op de reductie van permanganaat door de polyfenolen met behulp van de indicator carmino Indigo, waarvan de kleur varieert tussen blauw en geel afhankelijk van de oxidatietoestand., Het juiste eindpunt-wanneer de polyfenolen geoxideerd zijn maar niet de suikers-is moeilijk te identificeren, en bovendien is de reproduceerbaarheid van de methode slecht tussen operators.,ines according to their permanganate index (milliequivalents of permanganate used in the titration) as follows:
| Red press wine | 100–150 |
| Tannic red wine | 75 |
| Soft red wine | 60 |
| Rosé wine | 27–35 |
| White wine | 1–15 |
The Folin–Ciocalteu (F–C) index is a more reliable indicator of polyphenol content and is extensively used., Het reactiemengsel bestaat uit fosfotungstic en fosfomolybidic zuren, die in alkalisch medium, worden gereduceerd door de polyfenolen tot een mengsel van blauwe oxiden van wolfraam en molybdeen, waarvan de absorptie wordt afgelezen bij 750 nm. De F-C-index wordt uitgedrukt als 100 maal de extinctie van het monster; de typische waarden liggen tussen de 25 en 35.
Er zijn een aantal chemische methoden voor de bepaling van het totale gehalte aan anthocyaan in een wijn, de eenvoudigste zijn variaties in de kleur van een wijn als functie van de pH., Bij zeer zure pH zijn anthocyanen in hun flaviniumkationvorm, terwijl onder licht zure omstandigheden de carbinol pseudobase (Figuur 3) wordt gevormd. De absorptie van de wijn wordt afgelezen bij pH 0,6 en bij pH 3,5 en het verschil in absorptie is empirisch aangetoond dat het correleert met de anthocyanineconcentratie. De bepaling van anthocyanine met het verschil in absorptie voor en na de toevoeging van een bekende hoeveelheid zwaveldioxide is gebaseerd op hetzelfde principe.,
Het is ook mogelijk om wijnanthocyanen op basis van hun polymerisatiegraad te fractioneren op een met de hand verpakte kolom bestaande uit polyvinylpolypyrrolidon, silicagel G en silica 60. De vrije anthocyanen elueren in de eerste fractie (methanol-HCl 999:1), licht gepolymeriseerde anthocyanen in de tweede fractie (mierenzuur–water 1: 1), en de gecondenseerde polymere vormen worden geëlueerd in 100% mierenzuur., De extinctie van de drie fracties wordt spectrofotometrisch afgelezen (538 nm voor de eerste fractie en 525 nm voor de tweede en derde fractie) en hun relatieve verhoudingen kunnen dus worden berekend. Deze test is een zeer goede indicator van de leeftijd van een wijn: hoe jonger de wijn hoe hoger de absorptie van de eerste fractie als gevolg van de aanwezigheid van anthocyaan monomeren; omgekeerd zal de absorptie van de derde (gepolymeriseerde) fractie het grootst zijn in oudere wijnen.,
kwantificering van de totale tannineconcentratie wordt nog steeds uitgevoerd volgens methoden die gebaseerd zijn op de klassieke Bate–Smith-reactie: verhitting in sterk zuur medium leidt tot de vorming van carbokaties, die in een oxidant medium cyanidine (een anthocyanine) vormen. Het reactiemengsel wordt dus rood (vandaar de oude naam voor de tannines-proanthocyanidinen) en de absorptie wordt afgelezen bij 550 nm. Latere verfijningen van de oorspronkelijke methode uit 1954 leidden tot de integratie van verdere maatregelen in de techniek., Verschillende empirisch afgeleide berekeningen op basis van de absorptie bij 470, 520, 550 en 570 nm kunnen een redelijk nauwkeurige meting van het totale tanninegehalte van een wijn geven. Deze metingen maken echter geen onderscheid tussen tanninemonomeren, oligomeren of polymeren. Tannines produceren een gevoel van bitterheid of adstringency in de mond als gevolg van hun interactie met proline-rijke eiwitten en glycoproteïnen in speeksel., De tanninemoleculen die in dit opzicht het meest actief zijn, zijn die waarvan de molecuulmassa tussen 600 en 3500 ligt; tannines met een grotere molecuulmassa zijn te omslachtig om toegang te krijgen tot de actieve plaatsen van de eiwitten, en dit verklaart waarom tijdens de rijping van wijn, als tannines meer gepolymeriseerd worden onderling of met anthocyanen, ze minder agressief lijken voor het gehemelte. Uiteindelijk leidt deze polymerisatie tot moleculen die voldoende groot zijn om neer te slaan, wat de afzetting verklaart die vaak in oude wijnen wordt gezien., Dit principe van de reactie tussen tannines en eiwitten vormt de basis van een test, bekend als de gelatineindex, voor de mate van astringentie van een wijn. Een bepaalde hoeveelheid wijn wordt gemengd met een oplossing van gelatine (5000-30000 MM) en gedurende 3 dagen laten reageren en gecentrifugeerd. De tannineconcentratie van de wijn vóór en na de reactie met gelatine wordt bepaald zoals hierboven beschreven, en de index wordt uitgedrukt in procentuele verschillen. Hoe hoger de gelatine-index hoe groter de concentratie van ‘adstringerende’ tannines in de wijn., Deze test correleert redelijk goed met de mate van astringency waargenomen door deskundige proevers.