aangemaakt door Monica Z. Bruckner
Wat is gramkleuring?
gramkleuring is een veelgebruikte techniek die wordt gebruikt om twee grote groepen bacteriën te onderscheiden op basis van hun verschillende celwandbestanddelen. De Gramkleurprocedure maakt onderscheid tussen grampositieve en gramnegatieve groepen door deze cellen rood of violet te kleuren., Grampositieve bacteriën bevlekken violet toe te schrijven aan de aanwezigheid van een dikke laag peptidoglycan in hun celwanden, die kristalviolet behoudt deze cellen worden bevlekt met. Alternatief, de vlek rood van de gramnegatieve bacteriën, die aan een dunnere peptidoglycaan muur wordt toegeschreven, die het kristalviolet tijdens het ontkleuringsproces niet behoudt.
Hoe werkt gramkleuring?
gramkleuring omvat drie processen: kleuring met een in water oplosbare kleurstof genaamd kristalviolet, ontkleuring en contrakleuring, meestal met safanine., Door verschillen in de dikte van een peptidoglycaanlaag in het celmembraan tussen grampositieve en gramnegatieve bacteriën behouden Grampositieve bacteriën (met een dikkere peptidoglycaanlaag) kristalviolet tijdens het ontkleuringsproces, terwijl gramnegatieve bacteriën de kristalvioletvlek verliezen en in plaats daarvan door het safranine in het uiteindelijke kleuringsproces worden bevlekt. Het proces omvat drie stappen:
- cellen zijn gekleurd met kristalviolet kleurstof., Vervolgens wordt een Gram jodiumoplossing (jodium en kaliumjodide) toegevoegd om een complex te vormen tussen het kristalviolet en jodium. Dit complex is een groter molecuul dan de oorspronkelijke kristalviolet vlek en jodium en is onoplosbaar in water.
- aan het monster wordt een ontkleuringsmiddel zoals ethylalcohol of aceton toegevoegd, dat de peptidoglycaanlaag uitdroogt, krimpt en strakker maakt. Het grote kristal violet-jodium complex is niet in staat om deze aangescherpte peptidoglycaanlaag te penetreren, en is dus gevangen in de cel in Grampositieve bacteriën., Omgekeerd, wordt het buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën gedegradeerd en de dunnere peptidoglycaanlaag van gramnegatieve cellen kan het kristal violet-jodium complex niet behouden en de kleur wordt verloren.
- aan het monster wordt een tegenvlek toegevoegd, zoals de zwak in water oplosbare safranine, die het rood verkleurt. Aangezien safranine lichter is dan kristalviolet, verstoort het de paarse kleuring in grampositieve cellen niet. Nochtans, zijn de ontkleurde gramnegatieve cellen rood gekleurd.,
Kleuringprotocol en problemen:
reagentia:
- Crystal violet (primaire vlek)
- jodiumoplossing/Gram jodium (bijtende stof die kristalviolet aan de celwand fixeert)
- Decolorisator (bijv. ethanol)
- Safranine (secundaire vlek)
- Water (bij voorkeur in een spuitfles)
- maak een dia van het celmonster dat moet worden gekleurd. Verhit het monster op de dia door voorzichtig de dia met een druppel of klein stukje monster op het door een Bunsenbrander drie keer.,
- voeg de primaire vlek (kristalviolet) toe aan het monster/glaasje en incubeer gedurende 1 minuut. Spoel glaasje met een zachte stroom water gedurende maximaal 5 seconden om ongebonden kristalviolet te verwijderen.
- voeg Gram jodium gedurende 1 minuut toe – Dit is een beitsmiddel, of een middel dat het kristalviolet aan de bacteriële celwand fixeert.
- spoel Monster / schuif met aceton of alcohol gedurende ~3 seconden en spoel met een zachte stroom water. De alcohol zal het monster ontkleuren als het Gram negatief is, waardoor het kristalviolet wordt verwijderd., Nochtans, als de alcohol op de steekproef te lang blijft, kan het Gram positieve cellen ook ontkleuren.
- voeg de secundaire vlek, safranine, toe aan het objectglaasje en incubeer gedurende 1 minuut. Was met een zachte stroom water gedurende maximaal 5 seconden. Als de bacterie grampositief is, zal het de primaire vlek (kristalviolet) behouden en niet de secundaire vlek (safranine) nemen, waardoor het violet/paars onder een microscoop lijkt. Als de bacterie gramnegatief is, zal het de primaire vlek verliezen en de secundaire vlek nemen, veroorzakend om rood te verschijnen wanneer bekeken onder een microscoop.,