Diskusjon
Agarose gel elektroforese har vist seg å være en effektiv måte å skille nukleinsyrer. Agarose er høy gel styrke gjør for håndtering av lav prosentandel gels for separasjon av store DNA-fragmenter. Molekylær sikting er bestemt av størrelsen på porene generert av bunter av agarose7 i gel-matrise. Generelt, jo høyere konsentrasjon av agarose, jo mindre porestørrelse., Tradisjonell agarose-gel som er mest effektive på separasjon av DNA-fragmenter mellom 100 bp og 25 kb. For å skille DNA-fragmenter som er større enn 25 kb, vil man må bruke puls feltet gel electrophoresis6, som omfatter bruk av vekselstrøm fra to forskjellige retninger. På denne måten større størrelse DNA-fragmentene separeres ved den hastigheten som de snu seg med endringer i gjeldende retning. DNA-fragmenter som er mindre enn 100 bp er mer effektivt skilt ved hjelp av polyakrylamid gel elektroforese., I motsetning til agarose-gel, den polyakrylamid gel matrix er dannet gjennom en fri radikal drevet kjemisk reaksjon. Disse tynnere gels er av høyere konsentrasjon, kjøre vertikalt og har bedre oppløsning. I moderne DNA-sekvensering kapillær elektroforese brukes, der kapillær rørene er fylt med en gel-matrise. Bruk av kapillær rør åpner for anvendelse av høy spenning, og dermed muliggjør separasjon av DNA-fragmenter (og fastsettelse av DNA-sekvens) raskt.
Agarose kan endres for å skape lav smelte agarose gjennom hydroxyethylation., Lave smelte agarose brukes vanligvis når isolasjon av skilt DNA-fragmenter som er ønskelig. Hydroxyethylation reduserer pakking tetthet av agarose-bunter, som effektivt reduserer deres pore size8. Dette betyr at en DNA-fragment som er av samme størrelse vil ta lengre tid å gå gjennom en lav smelte agarosegel i motsetning til en standard agarose-gel. Fordi bunter forbinder med hverandre gjennom ikke-covalent interactions9, det er mulig å re-smelte en agarose gel etter at den har satt.
EtBr er den vanligste reagens som brukes til farging DNA i agarose gels10., Når de utsettes for uv-lys, elektroner i en aromatisk ring av ethidium molekylet er aktivert, noe som fører til frigjøring av energi (lys) som elektroner gå tilbake til bakken staten. EtBr verker av intercalating seg i DNA-molekylet i en konsentrasjon som er avhengige måte. Dette gir et estimat av mengden av DNA i en bestemt DNA-band basert på dens intensitet. På grunn av sin positive ladningen, bruk av EtBr reduserer DNA-migrering pris av 15%. EtBr er et mistenker mutagen-og kreftfremkallende, derfor må man utøve forsiktighet ved håndtering av agarose-gel som inneholder det., I tillegg, EtBr er ansett som farlig avfall og må kastes på riktig måte. Alternativ flekker for DNA i agarose gel inkluderer SYBR Gull, SYBR green, Crystal Violet og Methyl Blå. Av disse, Metyl-Blå og Krystall Fiolett ikke krever eksponering av gel for uv-lys for visualisering av DNA-båndene, og dermed redusere sannsynligheten for mutasjon dersom utvinning av DNA-fragment fra gel er ønsket. Men, deres følelser er lavere enn for EtBr., SYBR gull og SYBR green er både svært sensitive, uv avhengige fargestoffer med lavere toksisitet enn EtBr, men de er betydelig dyrere. Dessuten, alle av alternative fargestoffer enten ikke kan eller ikke fungerer godt når de legges direkte til gel, derfor gel er nødt til å være farget innlegg etter elektroforese. På grunn av pris, brukervennlighet, og følsomhet, EtBr er fortsatt fargestoff av valget for mange forskere. Men i visse situasjoner, for eksempel når farlig avfall er vanskelig eller når unge studenter er å utføre et eksperiment, som er et mindre giftig farge kan bli foretrukket.,
Mates fargestoffer som brukes i gel elektroforese tjene tre viktige formål. Først må de legge til tetthet for eksempel, slik at det å synke ned i gelen. For det andre, fargestoffer gir farge og forenkler lasting prosessen. Til slutt, fargestoffer flytte på standard priser gjennom gelen, slik at for estimering av avstanden, som DNA-fragmentene har migrert.
Den eksakte størrelser av skilt DNA-fragmentene kan bestemmes ved å plotte logg av molekylvekt for de forskjellige band av en DNA-standard mot distanse ved hvert bånd., DNA-standarden inneholder en blanding av DNA-fragmenter av en forhåndsinnstilt størrelser som kan sammenlignes mot den ukjente DNA-prøver. Det er viktig å merke seg at ulike former for DNA gå gjennom gelen på ulike priser. Supercoiled plasmider DNA, på grunn av sin kompakte konformasjon, beveger seg gjennom gelen raskest, fulgt av et lineært DNA fragment av samme størrelse, med åpne sirkulær form som reiser den tregeste.,
I konklusjonen, siden vedtakelsen av agarose gel på 1970-tallet for separasjon av DNA, det har vist seg å være en av de mest nyttige og anvendelige teknikker i biologiske fag forskning.