Diskussion
agarosegelelektroforese har vist sig at være en effektiv og effektiv måde at adskille nukleinsyrer på. Agaroses høje gelstyrke muliggør håndtering af lave procentuelle geler til adskillelse af store DNA-fragmenter. Molekylær sigtning bestemmes af størrelsen af porer genereret af bundterne af agarose7 i gelmatrixen. Generelt er jo højere koncentrationen af agarose, desto mindre er porestørrelsen., Traditionelle agarosegeler er mest effektive ved adskillelse af DNA-fragmenter mellem 100 bp og 25 kb. For at adskille DNA-fragmenter større end 25 kb skal man bruge pulsfeltgelelektroforese6, hvilket indebærer anvendelse af vekselstrøm fra to forskellige retninger. På denne måde adskilles DNA-fragmenter i større størrelse med den hastighed, hvormed de omorienterer sig med ændringerne i den aktuelle retning. DNA-fragmenter mindre end 100 bp adskilles mere effektivt ved anvendelse af polyacrylamidgelelektroforese., I modsætning til agarosegeler dannes polyacrylamidgelmatri .en gennem en fri radikal drevet kemisk reaktion. Disse tyndere geler har højere koncentration, køres lodret og har bedre opløsning. I moderne DNA-sekventering anvendes kapillær elektroforese, hvorved kapillarrør er fyldt med en gelmatri.. Anvendelsen af kapillarrør muliggør anvendelse af høje spændinger, hvorved adskillelsen af DNA-fragmenter (og bestemmelsen af DNA-sekvens) hurtigt muliggøres.
Agarose kan ændres for at skabe lavsmeltende agarose gennem hydro .yethylering., Lavsmeltende agarose anvendes generelt, når isoleringen af adskilte DNA-fragmenter ønskes. Hydro .yethylering reducerer pakningstætheden af agarosebundterne, hvilket effektivt reducerer deres porestørrelse8. Dette betyder, at et DNA-fragment af samme størrelse vil tage længere tid at bevæge sig gennem en lavsmeltende agarosegel i modsætning til en standard agarosegel. Fordi bundterne forbinder hinanden gennem ikke-kovalente interaktioner9, er det muligt at smelte en agarosegel igen, efter at den er indstillet.
EtBr er det mest almindelige reagens, der bruges til at plette DNA i agarosegeler10., Når de udsættes for uv-lys, aktiveres elektroner i den aromatiske ring af ethidiummolekylet, hvilket fører til frigivelse af energi (lys), når elektronerne vender tilbage til jordtilstand. EtBr virker ved at interkalere sig selv i DNA-molekylet på en koncentrationsafhængig måde. Dette giver mulighed for en estimering af mængden af DNA i et bestemt DNA-bånd baseret på dets intensitet. På grund af sin positive ladning reducerer brugen af ETBR DNA-migrationshastigheden med 15%. EtBr er et mistænkt mutagen og kræftfremkaldende stof, derfor skal man være forsigtig, når man håndterer agarosegeler, der indeholder det., Derudover betragtes etbr som et farligt affald og skal bortskaffes på passende måde. Alternative pletter til DNA i agarosegeler omfatter SYBR Gold, SYBR green, Crystal Violet og Methyl Blue. Af disse kræver Methylblåt og krystalviolet ikke eksponering af gelen for uv-lys til visualisering af DNA-bånd, hvorved sandsynligheden for mutation reduceres, hvis genvinding af DNA-fragmentet fra gelen ønskes. Imidlertid er deres følsomheder lavere end for EtBr., SYBR guld og SYBR green er begge meget følsomme, uv-afhængige farvestoffer med lavere toksicitet end EtBr, men de er betydeligt dyrere. Desuden kan alle de alternative farvestoffer enten ikke være eller fungerer ikke godt, når de tilsættes direkte til gelen, derfor skal gelen postfarves efter elektroforese. På grund af omkostninger, brugervenlighed og følsomhed forbliver etbr stadig det valgte farvestof for mange forskere. I visse situationer, såsom når bortskaffelse af farligt affald er vanskeligt, eller når unge studerende udfører et eksperiment, kan et mindre giftigt farvestof foretrækkes.,
indlæsning af farvestoffer anvendt i gelelektroforese tjener tre hovedformål. Først tilføjer de tæthed til prøven, så den kan synke ned i gelen. For det andet giver farvestofferne farve og forenkler indlæsningsprocessen. Endelig bevæger farvestofferne sig ved standardhastigheder gennem gelen, hvilket muliggør estimering af den afstand, som DNA-fragmenter har migreret.
de nøjagtige størrelser af adskilte DNA-fragmenter kan bestemmes ved at plotte loggen af molekylvægten for de forskellige bånd af en DNA-standard mod den afstand, der tilbagelægges af hvert bånd., DNA-standarden indeholder en blanding af DNA-fragmenter af forudbestemte størrelser, der kan sammenlignes med de ukendte DNA-prøver. Det er vigtigt at bemærke, at forskellige former for DNA bevæger sig gennem gelen i forskellige hastigheder. Supercoiled plasmid DNA, på grund af sin kompakte konformation, bevæger sig gennem gelen hurtigst, efterfulgt af en lineær DNA-fragment af samme størrelse, med den åbne cirkulære form rejser langsomste.,
afslutningsvis har det siden vedtagelsen af agarosegeler i 1970 ‘ erne til adskillelse af DNA vist sig at være en af de mest nyttige og alsidige teknikker inden for biologisk videnskab forskning.