Gram farvning

oprettet af Monica Br. Bruckner

Hvad er Gram farvning?

Gram farvning er en almindelig teknik, der anvendes til at differentiere to store grupper af bakterier baseret på deres forskellige cellevæg bestanddele. Gram-pletproceduren skelner mellem Gram-positive og Gram-negative grupper ved at farve disse celler røde eller violette., Gram positive bakterier pletter violet på grund af tilstedeværelsen af et tykt lag af peptidoglycan i deres cellevægge, som bevarer krystalviolet disse celler farves med. Alternativt gramnegative bakterier pletter rød, som tilskrives en tyndere peptidoglycan væg, som ikke bevarer krystal violet under affarvning proces.

Hvordan virker Gram farvning?

Gram farvning involverer tre processer: farvning med et vandopløseligt farvestof kaldet krystalviolet, affarvning og modfarvning, normalt med safanin., På grund af forskelle i tykkelsen af peptidoglycan lag i cellemembranen mellem Gram positive og Gram negative bakterier, Gram positive bakterier (med en tykkere peptidoglycan lag), bevarer krystal violet plet under blegning proces, mens de Gram negative bakterier, mister krystal violet farve, og er i stedet farves med safranin i den endelige farvning proces. Processen involverer tre trin:

1. celler er farvet med krystalviolet farvestof., Dernæst tilsættes en Grams jodopløsning (jod og kaliumiodid) for at danne et kompleks mellem krystalviolet og jod. Dette kompleks er et større molekyle end den oprindelige krystal violet plet og jod og er uopløseligt i vand.
2. en affarvningsmiddel, såsom ethylalkohol eller acetone, tilsættes til prøven, som dehydrerer peptidoglycan-laget, krymper og strammer det. Det store krystalviolet-jodkompleks er ikke i stand til at trænge ind i dette strammede peptidoglycan-lag og er således fanget i cellen i grampositive bakterier., Omvendt nedbrydes den ydre membran af gramnegative bakterier, og det tyndere peptidoglycan-lag af gramnegative celler er ikke i stand til at bevare krystalviolet-jodkomplekset, og farven går tabt.
3. en modvægt, såsom det svagt vandopløselige safranin, sættes til prøven, farvning det rødt. Da safranin er lettere end krystalviolet, forstyrrer den ikke den lilla farve i Gram-positive celler. Imidlertid farves de affarvede Gram-negative celler rødt.,

Sådan – farvningsprotokol og Bekymringer:

Reagenser:

• krystalviolet (primære plet)
• Jod løsning/Gram ‘ s Jod (bejdsemiddel, der løser krystalviolet til cellevæg)
• Decolorizer (fx ethanol)
• Safranin (sekundær plet)
• Vand (helst i en sprøjte flaske)

1. Gør et dias af celle-prøve, der skal farves. Heat fastgør prøven til objektglasset ved forsigtigt at føre objektglasset med en dråbe eller et lille stykke prøve på det gennem en bunsenbrænder tre gange.,
2. tilsæt den primære plet (krystalviolet) til prøven/glideren og inkuber i 1 minut. Skyl objektglasset med en blid vandstrøm i maksimalt 5 sekunder for at fjerne ubundet krystalviolet.
3. Tilføj Grams jod i 1 minut-dette er en mordant eller et middel, der fikserer krystalviolet til bakteriecellevæggen.
4. skyl prøve/skub med acetone eller alkohol i ~3 sekunder og skyll med en mild vandstrøm. Alkoholen vil affarve prøven, hvis den er gramnegativ, idet krystalviolet fjernes., Men hvis alkoholen forbliver på prøven for længe, kan den også affarve Gram-positive celler.
5. tilføj den sekundære plet, safranin, til objektglasset og inkub forr i 1 minut. Vask med en mild vandstrøm i højst 5 sekunder. Hvis bakterierne er grampositive, beholder den den primære plet (krystalviolet) og tager ikke den sekundære plet (safranin), hvilket får den til at se violet/lilla ud under et mikroskop. Hvis bakterierne er gramnegative, mister den den primære plet og tager den sekundære plet, hvilket får den til at blive rød, når den ses under et mikroskop.,

litteratur

relaterede Links

undervisningsaktiviteter