mönster av cellcykelkontrollpunktsavreglering i samband med inneboende molekylära subtyper av humana bröstcancerceller

dekatenationen G2-kontrollpunkten är nedsatt i Lomb-bröstcancercellinjer

för att bedöma G2/M-kontrollpunktsfunktionen användes en MER-analys med två Topo II-hämmare som uppvisade distinkta verkningsmekanismer för att övervaka G2-M-övergångsperioden.betygsätt., Celler inkuberades med colcemid (för att förhindra mitotiska exit (avsluta) för 2-6 h i närvaro eller frånvaro av topo II katalytisk hämmare ICRF-193 (som inte öppet skada DNA) för att mäta decatenation G2 checkpoint funktion eller topo II gift etoposid (som inducerar DNA-skador) för att mäta DNA-skador G2 checkpoint funktion vid koncentrationer att gripa 98-100% av den normala mänskliga diploida fibroblaster (NHF1-hTERTs) och förevigade lymfoblaster i G2.,36 användningen av colcemid i MER-analysen blockerar celler från att lämna mitos, vilket möjliggör en strikt undersökning av G2-M-övergången, vilket minimerar eventuella konforeffekter relaterade till mitotisk exithastighet. Meren beräknades från den linjära delen av den resulterande linjen (2-6 h-tidpunkter) och uttrycks som procentandelen celler som kommer in i mitos per timme.36

Mer exempel visas för hmec cellinjen R-HMEC-e i den vänstra panelen i Fig 2a., Dessa celler ackumuleras i mitos när inkuberas i colcemid (och vehikelkontroll dimetylsulfoxid (DMSO), slutna rutor) återspeglar deras övergång från G2 till M; men i närvaro av den katalytiska inhibitorn ICRF-193 (öppna cirklar), mitotisk ackumulering av R-hmec-e-celler inhiberades kraftigt tyder på att majoriteten av dessa celler aktiverar en dekatenation G2 kontrollpunkt svar., I närvaro av Topo II-giftet etoposid hämmades också den mitotiska ackumuleringen av R-HMEC-e-celler kraftigt (slutna trianglar), vilket indikerar att denna celllinje uppvisar en effektiv DNA-skada G2-kontrollpunkt. Omvänt fortsatte LumB bröstcancer cellinjen mda-MB-453 att ackumuleras i mitos i närvaro av ICRF-193, men inte etoposid (Fig. 2a, höger panel), vilket tyder på att en majoritet av dessa celler undvek dekatenation G2 checkpoint men greps i G2 på DNA-skada.

alla 24 cellinjer utsattes för kontrollpunktsanalysen MER-based G2 och medelvärdena för tre oberoende experiment för varje cellinje (grupperade enligt molekylär subtyp) visas i Fig. 2b (medelvärden för enskilda cellinjer ± sem anges i tabell S1)., Som förväntat, alla fyra positiva kontroll hmec cellinjer visade svår MER hämning som svar på ICRF-193 tyder på att denna klass uppvisar en effektiv dekatenation G2 checkpoint. Däremot var checkpoint-funktionerna hos bröstcancercelllinjerna mycket variabla (Fig. 2b). Vid gruppering av celllinjerna av inneboende molekylär subtyp verkade LumB-och BL-celllinjerna uppvisa försvagad dekatenation G2-kontrollpunktsfunktion, medan HER2E-och Cl-subtyperna visade kontrollpunktsfunktion som liknar hmecs., En uppsättning statistiska linjära blandade modeller (LMM) användes för att jämföra G2-kontrollpunktsfunktioner mellan de olika undertyperna (se Kompletterande Information, (SI)). Dessa analyser visade att LumB-klassen (men inte BL-klassen) av bröstcancercellinjer uppvisade defekter i dekatenation G2 checkpoint-funktionen (**p < 0.05, FDR < 0.05)., Även om fördelningen av % inhibering av MER i BL-cellinjerna ursprungligen verkade lik den hos LumB-gruppen, visade närmare inspektion av MER-data att BL-gruppen uppvisade mycket låga MERs i frånvaro av en Topo II-katalytisk hämmare, vilket indikerar att denna grupp inte svarade på colcemid-behandling; således verkar procentinhiberingen av MER artificiellt låg i BL-gruppen.,

kompletterande experiment utfördes för att bedöma om bröstcancercellinjer kunde aktivera DNA-skadorna G2-kontrollpunkten med hjälp av en koncentration av Topo II-giftet etoposid motsvarande den hos katalytisk hämmare ICRF-193 (4 µM). Alla fyra hmec cellinjer visade en effektiv DNA skada G2 checkpoint som svar på etoposid (Fig. 2c)., Majoriteten av bröstcancercellinjerna uppvisade också stor MER-inhibering i närvaro av etoposid och inga signifikanta skillnader observerades för någon av bröstcancercellinjeklasserna. således kunde dessa bröstcancercellinjer aktivera DNA-skadorna G2-kontrollpunkten vid nivåer som var jämförbara med hmecs, med undantag för Du4475-Lumbcellinjen (tabell S1).,

för att bekräfta Att ICRF-193 kunde hämma topo II aktivitet i LumB cellinjer, cytogenetiska preparat undersöktes i närvaro eller frånvaro av ICRF-193 och representant metaphases av två LumB cell-linjer som visas i Fig. 2d. i närvaro av DMSO uppvisade majoriteten av Lumbmetafaserna individualiserade kondenserade kromosomer. Vid hämning av topo II med ICRF-193 visade>88% av alla Lumbmitotiska celler kromosomer som var underkondenserade och/eller intrasslade (data visas inte)., Alltså, observerade brister i decatenation G2 checkpoint funktion var osannolikt att vara resultatet av ett misslyckande av ICRF-193 att hämma topo II katalytisk aktivitet i LumB klass, som stöder slutsatsen att felet beror på dysfunktionella checkpoint aktivering och inte en oförmåga LumB klass för att svara på ICRF-193 behandling.

tidigare studier visar att p53 aktiveras som svar på ICRF-193, och cellinjer med defekt dekatenation G2 checkpoint-funktion uppvisar försvagad aktivering av p53.,36, 37 Därför LumB och HMEC klasser undersöktes för att avgöra om cell-linjer som saknar en decatenation G2 checkpoint uppvisar försvagade p53 fosforylering. För att underlätta jämförelser mellan olika blottar och redovisa exponeringsskillnader lastades samma nhf1-hTERT-prov på varje gel och ökningen av aktiveringen av p-Ser15 p53 för varje celllinje normaliserades till nhf1-hTERT intern kontroll. Som visas i den övre panelen av Fig. 2e, alla fyra HMEC cellinjer svarade att ICRF-193 med induktion av totalt p53 och p-Ser15 p53., Större ökningar av p-Ser15-p53 observerades vid etoposidbehandling i majoriteten av hmec-cellinjer, vilket innebär att aktivering av p53-signalering med ICRF-193 i HMECs liknar den som observerats i andra icke-tumorigeniska cellinjer.36 däremot visade Lombcelllinjerna dämpad induktion av p-Ser15 p53 som svar på ICRF-193 (Fig. 2e, Bottenpanel). Minst två av dessa cellinjer (HCC1428 och MDA-MB-453) verkade uttrycka låga eller odetekterbara nivåer av p53 trots att de hyser wildtype TP53-gener.,38 endast mda-MB-415-celllinjen uppvisade en mutantform (Y236C) och höga basala nivåer av p53, vilket tyder på att p53-aktiveringen försvagades av en annan mekanism än mutation i de flesta Lomblinjerna. Ökningen av p-Ser15 p53 vid etoposidbehandling för LumB-klassen skilde sig inte statistiskt från hmec-klassen (Fig. S1B), vilket tyder på att försvagad signalering inte berodde på förlusten av en inneboende förmåga att fosforylatser15 av p53, utan snarare var mindre mottaglig för Topo II-katalytisk hämning.,

Aktivering av p-Ser 1981 av ATM och p-Thr 68 av Chk2 kan bidra till p-Ser15 aktivering av p53 och har också observerats på ICRF-193 exponering;36 dock inga signifikanta skillnader i ATM eller Chk2 aktivering observerades i LumB klass jämfört med de HMEC klass, sannolikt på grund av höga nivåer av variationen bland cell-linjer (Fig. S1A–B). Västra blottar av alla cellinjer som består av de återstående inneboende subtyperna visas i Fig. S1C-G., Ingen av de inneboende subtyperna uppvisade en statistiskt signifikant minskning av ATM eller Chk2 jämfört med hmec-klassen vid antingen ICRF-193 eller etoposidexponering (Fig. Her2E-klassen visade emellertid också dämpad aktivering av p53 som svar på ICRF-193. På grund av den korta exponeringstiden (3 h) kan detta bero på Her2E-linjernas långsammare tillväxttakt enligt beskrivningen nedan. Sammantaget indikerar dessa resultat att LumB-klassen har en defekt dekatenation G2-kontrollpunkt.,

Bröstcancercellinjer uppvisar förändrad S/G2/M cellcykelprogression

under den ursprungliga G2 / M-kontrollpunktsskärmen uppvisade flera cellinjer en låg MER (tabell S1)., Eftersom tolkningen av checkpoint-funktionen kan begränsas av differentiell tillväxt, bedömdes celllinjepanelen för differentialmönster för cellproliferation och/eller avreglerad cellcykelprogressionskinetik för att ta hänsyn till inneboende skillnader i cellcykelfaslängd som kan störa tolkningen av G2/M-kontrollpunktsfunktionalitetsexperimenten och för att säkerställa att LumB-defekten i dekatenation G2-kontrollpunktsfunktionen inte kunde hänföras till inneboende skillnader i MER., Sådana förvirringseffekter har tidigare rapporterats och beror ofta på beroendet av vissa kontrollpunktsanalyser på singulära markörer för cellproliferation.36

tre mått på cellproliferation jämfördes via flödescytometri inklusive S-fasfraktionen som bestäms genom Edu-inkorporering (er), mitotiskt index (MI) mätt med MPM2+/4N DNA-innehåll och MER., Antalet populationsfördubblingar (PDLs) som inträffade under kontinuerlig odling bestämdes också genom att räkna det totala antalet celler under varje passage och beräkna fördubblingstiden för varje celllinje (PDL/vecka). I Fig. 3 a-d, de enskilda medelvärdena för varje celllinje avbildas och grupperas efter molekylär subtyp. (Medelvärden för varje cellinje ± sem finns i tabell s2).

i Fig. 3a: s-fasfraktionerna av subtyperna Her2E och LumB föreföll vara lägre än de andra klasserna., LMM analys som stöds observation av en minskning i S för Her2E klass, men minskningen i LumB linjer var inte statistiskt signifikant vilket tyder på att HMEC, BL, CL, och LumB klasser uppvisar jämförbara procentsatser av celler som genomgår DNA-replikation. I Fig. 3b, BL cellinjer uppvisade en ökad MI jämfört med den HMECs, och LMM analys förstärkt denna observation som tyder på att de HMEC, CL, LumB, och Her2E klasser uppvisar liknande MIs. I Fig., 3c, MER av BL, CL, och Her2E klasser var lägre än HMEC klass; dessa iakttagelser bekräftades av LMM analys och föreslår att endast HMEC och LumB klasserna uppvisade liknande MERs. I Fig. 3d, PDL mätningar föreslog att LumB och Her2E subtyper har lägre PDLs, och LMM analys validerade som båda klasserna uppvisade betydligt lägre PDLs jämfört med den HMEC klass., LumB-klassen var jämförbar med hmec-klassen genom alla andra mått på cellproliferation, vilket indikerar att en MER-jämförelse av hmec-och LumB-klasserna var ett lämpligt mått på både dekatenation och DNA-skada G2-kontrollpunktsfunktionen i Lombcellinjer. (**p < 0,05, FDR < 0,05)

eftersom slutförandet av DNA-replikation är kopplad till uppkomsten av mitos, ökar samtidig flera åtgärder av cellproliferation (Fig., 3a-C) förväntas förekomma i celler som upprätthåller strikt regulatorisk kontroll över S/G2 / M cellcykelprogression för att bevara ett diploidgenom.39, 40 omvänt skulle detta förhållande störas om cellcykelfasövergångar avreglerades. Således bedömdes två intilliggande markörer för cellcykelfasen för närvaron av ett korrelativt förhållande, 41 och en frånvaro av korrelation mellan dessa markörer skulle innebära att övergången mellan dessa två cellcykelfaser försenades och/eller avvikande reglerades.,

hmec-och Lumbklasserna uppvisade ett mycket korrelativt förhållande mellan S-fasfraktionen och MI (p < 0.0001 respektive 0.0041, Tabell 1), vilket tyder på att cellcykeln övergår mellan S/G2/M-faserna följer en ordnad progression. BL -, Cl-och Her2E-klasserna uppvisade emellertid inget korrelativt samband mellan S-fasfraktionen och MI, vilket tyder på att cellcykelprogressionen är fördröjd eller aberrantly reglerad vid någon tidpunkt mellan initieringen av DNA-replikation och mitotisk utgång., För att ytterligare förfina de avreglerade punkterna i cellcykeln jämfördes s-fasfraktionen med MER-mätningen för att avgöra om S-eller G2-progression fördröjdes. Endast hmec-klassen (p = 0.0006) uppvisade en korrelation mellan S och MER; alla bröstcancercelllinjeklasser visade frikoppling av s-fasfraktionen och MER vilket tyder på att dessa klasser kan spendera längre tidsperioder i S-eller G2-faserna eller uppvisa avvikande cellcykelkontroll under S/G2., Slutligen uppvisade hmec -, LumB-och CL-klasserna ett korrelativt förhållande mellan tidsberoende MER och MI (p = 0.012, p < 0.0001 respektive p = 0.0051) vilket tyder på att dessa klasser upprätthåller beställd mitotisk progression. Däremot visade BL-och Her2E-klasserna ingen signifikant korrelation mellan MER och MI, vilket indikerar att dessa klasser kanske inte svarar på mikrotubulpolymerisationshämmaren colcemid och/eller uppvisar svårigheter att slutföra mitos. (*p < 0.05, **p < 0.,05, FDR < 0,05)

endast den icke-tumorigeniska hmec-klassen uppvisade ett korrelativt förhållande mellan alla tre spridningsmarkörer, vilket tyder på att reglering av cellcykeln i hmecs är kopplad, sker i en ordnad progression och illustrerar den tätt kontrollerade regleringen av S/G2/M progressionskinetik i icke-tumorigeniska celler., Bröstcancercellinjer uppvisade däremot avreglering av en eller flera olika cellcykelfaser, vilket tyder på att S / G2 / M-progressionen fördröjdes eller ändrades. BL-och Her2E-klasserna visade inga korrelativa relationer, vilket tyder på att flera defekter i cellcykelreglering var närvarande. Eftersom data i Fig. 3a – d visar att Her2E-klassen också uppvisade lägre spridningshastigheter i kultur jämfört med hmecs, vi är ovilliga att dra slutsatser om cellcykelkontrollpunktens funktion i cellinjer i Her2E-klassen utan ytterligare data., Sammanfattningsvis tyder dessa data på att bröstcancerundertyper är associerade med förändrad reglering av S/G2/M-progression och att BL-och CL-klasserna kan uppvisa S/G2/M-progressionsfel som undvikit detektion genom MER-analysen.,

CL och BL bröstcancercellinjer har chromatid sammanhållningsfel; säcken är nedsatt i BL bröstcancercellinjer

för att avgöra om BL-och CL-klasserna uppvisade S/G2/M-kontrollpunktsdefekter som inte identifierades av MER-skärmen analyserades metafaser för att utvärdera brutto-kromosomala strukturavvikelser som ofta indikerar kontrollpunktsdefekter. Alla metafaser gjordes på ett blind sätt, och exempelspridningar visas i Fig. 4a för en hmec -, BL-och Cl-celllinje., Sammantaget uppvisade metafaserna i LumB-och Her2E-klasserna liknande sannolikheter för att hysa en sammanhållningsfel jämfört med hmec-klassen (tabell S3A, p = 0.1674 respektive p = 0.4743). Däremot verkade klasserna CL och BL uppvisa en ökad sannolikhet att hysa sammanhållningsfel som varierade från mild till svår (Fig. 4a).

på grund av variabla intervall av sammanhållning defekt svårighetsgrad, metafaser undersöktes via en hög känslighet fluorescens in situ hybridization (FISH) analys utnyttja en sond som riktar centromeren av kromosom 9 (CEP9) för att bekräfta förekomsten av sammanhållningsfel och utvärdera svårighetsgraden i BL och CL klasser., I diploida metafasceller med korrekt kohererade systerkromatider är systerkromatidernas centromerer så nära varandra att de verkar vara en enda CEP9-plats vid fiskfärgning. I celler som uppvisar sammanhållningsfel separeras de centromera regionerna av systerkromatiderna och uppvisar ett dubbelt mönster som innehåller två visuellt distinkta cep9-loci. Grader av sammanhållningsfel definierades som milda, måttliga eller svåra,42 och exempel visas i Fig. 4b med vita pilar som anger varje typ av sammanhållningsfel., BL-och CL-klasserna visade både ökningar i den totala andelen celler med sammanhållningsfel, vilket tyder på att dessa klasser kan uppleva svårigheter att slutföra DNA-replikering och/eller partitionering av systerkromatider lika i dotterceller. Dessutom skilde sig fördelningen av svårighetsgraden av sammanhållningsfel i båda klasserna också jämfört med HMECs, vilket tyder på att ett ökat antal måttliga/allvarliga sammanhållningsfel hittades i dessa klasser (Fig. 4b, nedre panel)., Dessutom, både BL och CL klasserna uppvisade betydligt högre halter av celler med aneuploidi jämfört med HMECs (>4 CEP9 härdar per metafas), vilket tyder på att sammanhållningen fel kan leda till en olämplig uppdelning av dubblerade kromosomer under cytokinesis och bekräfta förekomsten av genomisk instabilitet i dessa klasser (Fig. S2 och Tabell S3B).

eftersom MERs i klasserna CL och BL var låga jämfört med hmec-klassen (Fig. 3C), förekomsten av sammanhållningsfel (Fig., 4a, b) har tidigare visats aktivera säcken,43 och svår aneuploidi observerades i båda klasserna (tabell S5B, Fig. S2), var det möjligt att BL och CL klasser hyste SAC fel. Således mättes antalet mitotiska celler som ackumulerades under en 24-timmarsperiod i närvaro/frånvaro av kolcemid genom flödescytometri.,19, 44 denna analys gör det möjligt för oss att skilja mellan cellinjer som uppvisar en låg MER på grund av långsam rörelse genom S och/eller G2-fasen (märkbara nivåer av mitotisk ackumulering i närvaro av colcemid förekommer över 24 h) och cellinjer som saknar en funktionell SAC (ingen mitotisk ackumulering på grund av oförmåga att arrestera i colcemid). Exempel flödescytometri profiler för MCF10As (HMEC) och MDA-MB-468s (BL) visas i den vänstra panelen i Fig. 4c., Tillägg av 100 ng/mL colcemid dramatiskt ökat antalet av mitotiska celler i MCF10As, medan antalet av mitotiska celler minskade i MDA-MB-468s (Fig. 4C, Mellersta paneler). Den genomsnittliga ökningen av mitotiskt index för varje cellinje grupperad efter inneboende molekylär subtyp visas för tre oberoende experiment (höger panel, Fig. 4c). Individuella celllinjemedelvärden finns i tabell S4. Både BL och Her2E klasser verkade uppvisar en defekt SAC, och LMM analys bekräftade att SAC funktion var nedsatt i BL klassen., Även om en BL – cellinje (SUM149) uppvisade viss mitotisk ackumulering i närvaro av kolcemid, är detta resultat sannolikt på grund av närvaron av en subpopulation av CL-celler som finns i denna cellinje.Dessa data tyder tillsammans på att de kombinerade sammanhållningsfel och avvikande SAC-funktion som identifierats i BL-klassen kan bidra till de höga nivåer av genomisk instabilitet som observerats vid BL-bröstcancer., Närvaron av en effektiv SAC i cl-klassen tyder på att sammanhållningsfel i dessa cellinjer kan aktivera säcken och att den allvarliga aneuploidi som observeras sannolikt beror på en alternativ mekanism för genomisk instabilitet. (*p < 0.05, * * p < 0.05, FDR < 0.,5)

en dekatenation G2 checkpoint genuttryck signatur korrelerar med kliniska resultat av bröstcancerpatienter

för att avgöra om kontrollpunkten defekter som identifierats i celllinjen panelen var associerade med kliniska resultat, en genuttryck signatur av dekatenation G2 checkpoint funktion identifierades från celllinjen panelen med hjälp av kvantitativ drag analys (Qta) (tabell S5)., Denna signatur applicerades på den METABRISKA kliniska datauppsättningen, som innehåller cirka 2000 brösttumörprover som inkluderar kliniska anteckningar, inneboende molekylär subtypinginformation och genuttrycksdata.45 I en univariat analys, decatenation G2 checkpoint signatur var signifikant associerade med bättre överlevnad i alla brösttumörer (HR: 0.7391, CI: 0.5759–0.9486, log rank p = 0.0176, Fig. 5a). I en multivariatanalys, inklusive de inneboende molekylära subtyperna, var checkpointsignaturen inte signifikant associerad med total överlevnad (HR: 0.,76843, CI: 0, 5769–1, 023, log rank p = 0, 071673), men var nära signifikant.

dekateneringen G2 checkpoint signaturen var också prediktiv för OS-resultat hos LumA-patienter (HR: 0.6039, CI: 0.4559-0.7998, p = 0.01741, Fig. 5B), vilket tyder på att nedsatt dekatenation G2 checkpoint funktion kan bidra till dåliga resultat i LumA subtyp. Median dekatenation G2 checkpoint signatur för alla brösttumörer varierade mellan undertyper (p = 1,73 e–133, Fig., 5C) med LumB-subtypen som uttrycker den lägsta mediankontrollpunktens signatur; denna observation verifierades oberoende med hjälp av datauppsättningen UNC337 (p = 8.46 e–20, tabell S6).27 även om dekatenationen G2 checkpoint-signaturen inte var signifikant associerad med resultat inom LumB-subtypen (p = 0.597, tabell S6), kan detta bero på den inneboende låga median dekatenationen G2 checkpoint-signaturen inom denna undertyp., Till exempel, om majoriteten av LumB tumörer är defekt för decatenation G2 checkpoint funktion, det kanske inte finns tillräckligt med variation av signaturen inom LumB subtyp att förutsäga utfall. Sammantaget innebär dessa data att kontrollpunkten för dekatenation G2 kan vara ett kliniskt relevant mål för behandling av LumA-och/eller LumB-bröstcancerpatienter.