gränser i bioengineering och bioteknik

Mesenchymal Stromal celler

sedan beskrivs av Friedenstein (Friedenstein et al., 1966), mesenkymala stamceller / stromala celler (MSCs) har varit fokus för forskningsinsatser för att utnyttja deras terapeutiska potential. På grund av sin immunevasiva natur frigör MSCs immunmodulerande faktorer som gör det möjligt för dem att undkomma avstötningsmekanismer för tillräcklig tid för att utöva sin terapeutiska verkan (Ankrum et al.,, 2014). MSCs uttrycker också en mängd cytokin-och kemokinreceptorer, såsom CXCR4, CXCR7 och CCR7, vilket möjliggör migrering till skador och inflammationsställen (Sasaki et al., 2008; Liu m.fl., 2012).

som ett paradigm för vävnadsregenerering har MSCs använts för många ortopediska tillstånd, inklusive artros (oa). Den första framgångsrika behandlingen använde en getmodell av OA som involverar främre korsbandstransektion i kombination med total medial meniscektomi (Murphy et al., 2003)., Direkt intraartikulär (IA) leverans av autolog benmärg (BM)-MSCs, 6 veckor efter skada, ledde till menisk reparation och kondroskydd. Det gröna fluorescerande proteinet (GFP)-transducerade celler detekterades i synovialkapseln, fettkudden och nybildad menisk, men inte i ledbrusk. Detta arbete ledde till hypotesen att MSCs verkar via alternativa mekanismer för cellbyte, dvs trofiska mekanismer för att främja vävnadsregenerering genom modulering av värdmiljön och / eller stimulering av endogena stamceller (Jeong et al., 2013)., Studien validerades därefter i andra prekliniska modeller av OA (Barry och Murphy, 2013). I allmänhet överför detta fenomen till andra sjukdomsscenarier, som granskats omfattande av Prockop et al. (Prockop, 2009). Mer nyligen har fas i-studier visat att MSCs också har klinisk nytta vid modulering av OA (Jo et al., 2014; Pers m.fl., 2016); ett antal opublicerade Fas 2-studier pågår för att bedöma fett som härrör Msc i OA inklusive ADIPOA2 (http://adipoa2.eu/).,

MSCs försvinner snabbt från målvävnaden efter administrering, men kan fortfarande leverera kondroprotektiva och immunmodulerande effekter (ter Huurne et al., 2012). Eftersom deras terapeutiska effekt verkar vara oberoende av deras engraftment, anses den nu vara huvudsakligen parakrinmedierad. Den alltmer accepterade modellen är att MSCs finns vilande in vivo som pericyter (Crisan et al., 2008). Dessa deltar i utvecklingen av vävnader, inklusive synovium, och är involverade i vävnadsreparation under vuxenlivet (Roelofs et al., 2017)., En gång aktiverad som svar på signaler som är associerade med den skadade miljön, såsom proinflammatoriska cytokiner, ett fenomen som allmänt kallas ”licensiering”, utsöndrar de faktorer, inklusive kemokiner och cytokiner, för att skapa en regenerativ miljö. Beroende på miljön av den specifika sjukdomen kan Anti-apoptotiska och antifibrotiska faktorer begränsa omfattningen av skador för att förbättra vävnadsläkning (Ryan et al., 2017). Vävnads-inneboende stamceller uppmanas att föröka sig och differentiera, medan kemoattraktanter rekrytera endogena stamceller till platsen för skadan., Samtidigt kan aktiverade MSCs modulera immunsvaret lokalt genom att selektivt hämma proliferationen av immunceller (Aggarwal och Pittenger, 2005) (Figur 1). Detta dokument kommer att granska bevisen för dessa terapeutiska effekter i modeller som är relevanta för OA, antingen in vivo eller in vitro (sammanfattas i Tabell 1). Det kommer att vara avgörande i framtiden att validera dessa fynd med hjälp av nyligen isolerade stromala celler.

MSC Secretome

MSCs visar en rik sekretorisk profil som förbättras genom exponering för inflammatoriska signaler. Ett proteomik-tillvägagångssätt identifierade 118 proteiner differentiellt uttryckta av humana fettderiverade stamceller (ASC) vid tumörnekrosfaktor (TNF)-α-stimulering (Lee et al., 2010)., Dessa inkluderade många cytokiner och kemokiner , proteaser och proteashämmare , extracellulära matrismolekyler (ECM) och faktorer som är involverade i immunreglering och cellsignalering.

apoptos

Chondrocyte apoptos har associerats med degenerativ OA i många år (Aigner et al., 2004; Del Carlo och Loeser, 2008)., Även om det inte finns några rapporter om direkta Anti-apoptotiska effekter av MSCs i samband med OA, tyder indirekta bevis på att exosomer erhållna från mänskliga MSCs och genom inferens bestående av utsöndrade faktorer, hämmade IL-1β-inducerad apoptos av ex vivo-odlade oa-kondrocyter (Liu et al., 2018a). Dessutom främjade MSC-härledda exosomer kondrocytproliferation i en råttmodell av OA, genom att blockera miR-206 med lncRNA-KLF3-AS1 (Liu et al., 2018b)., Trots att lösliga faktorer inte visades i modeller av OA svarade MSCs på två olika apoptotiska cellinjer in vitro genom ökat uttryck och utsöndring av det Anti-apoptotiska hormonet stanniocalcin (STC)-1 (Block et al., 2009). Framtida arbete med att titta på gemensamma MSC anti-apoptotiska effekter kommer sannolikt att identifiera direkta medlare av processen.

fibros

Maumus et al. co-odlade autolog Asc med kondrocyter som härrör från OA patienter i en transwell system (Maumus et al., 2013)., Författarna observerade påtagliga minskningar i uttryck nivåer av hypertrofiska och fibrotiska markörer MMP-13, alkaliskt fosfatas, Runx2, collagens typ i, III, VI och vimentin, liksom en ökning med 40% av TGF-β1 sekretion. Genom att använda en neutraliserande antikropp identifierades HGF som huvudmediator för den anti-fibrotiska effekten. Dessa data är av särskild betydelse eftersom HGF-koncentrationen i synovialvätska har en direkt korrelation med svårighetsgraden av OA (Dankbar et al., 2007). MSCs hämmar också fibros in vivo genom bFGF (Suga et al., 2009) och adrenomedullin (Li et al., 2009)., Dessutom föreslog ett antal studier att in vivo-administrerade MSCs utsöndrade TSG-6 och indirekt förhindrade fibros genom att undertrycka det tidiga inflammatoriska svaret på olika sjukdomar än OA, inklusive hjärtinfarkt (Lee et al., 2009), peritonit (Choi et al., 2011), inflammation av hornhinnan (Oh et al., 2010), och hornhinnan transplantatavstötning avslag (Oh et al., 2012).

vävnadsmetabolism

bland andra aktiviteter bryter MMP ner ECM och regleras av specifika hämmare som kallas TIMPs., I OA störs balansen mellan anabola och kataboliska faktorer till förmån för den senare (Lohmander et al., 1993). MMP-2, -9 och -13 detekterades vid högre nivåer i humant oa-brosk jämfört med frisk vävnad (Jackson et al., 2014). Dessutom minskade MMP-13 korrelerade med förbättrad osteokondral reparation hos råttor behandlade med doxycyklin (Lee H. et al., 2013) och MSCs utsöndrar konstitutionellt höga nivåer av TIMP – 2 och -1, vilket hämmar MMP-2 respektive MMP-9., Under patologisk stress (IL-1β, TNF-α, hypoxi) TIMP-1 utsöndring är upregulated för att motverka ökade katabola aktivitet (Lozito och Tuan, 2011). Dessutom är MMP-inhibering inte specifik; TIMP – 1 kan hämma de flesta MMPs (Visse och Nagase, 2003), vilket gör MSCs till ett ännu mer mångsidigt verktyg för att återställa den metaboliska balansen i degenererande brosk.

Kondrogenes

Matricellulära proteiner, utsöndrade matrisproteiner med regulatoriska Roller, binder till ECM och fungerar som receptorer för cell-ytmolekyler, tillväxtfaktorer och MMPs (Bornstein et al., 2000)., Trombospondin (TSP2) är till exempel en känd regulator för brosk och bendifferentiering och utsöndras av MSCs för att inducera proliferation via autokrina mekanismer (Hankenson och Bornstein, 2002). TSP2, som utsöndras av Human navelsträngsblod (UCB) – MSCs som behandlas med synovialvätska från OA-patienter, inducerade differentiering av kondroprogenitorceller. Det främjade broskregenerering i en kaninmodell med full tjocklek (Jeong et al., 2013)., TSP2 befanns ha en autokrin verkan på humana UCB-MSCs, BM-MSCs och ASCs, främja broskdifferentiering och förhindra hypertrofi (Jeong et al., 2015). Även om data är begränsade finns det bevis för att tsp2 är en av de viktigaste parakrinaktörerna i MSC-medierad broskregenerering.

immunsuppression

inflammationens roll vid etablering och underhåll av OA är nu allmänt accepterad (Ayral et al., 2005) med synovialmembraninflammation ett kännetecken för OA-patologi (Goldring, 1999; Pelletier et al., 2001)., Histologiska studier visar att OA-patienter har varierande grader av synovit, med högre nivåer av proinflammatoriska cytokiner och infiltrering av immunceller, övervägande makrofager (Benito et al., 2005). Biologiska markörer av inflammation korrelerar positivt med knäsmärta (Baker et al., 2010; Scanzello et al., 2011) och kliniska utvecklingen av sjukdomen (Krasnokutsky et al., 2011; Roemer et al., 2011)., Licensierad MSCs utsöndrar en mängd anti-inflammatoriska cytokiner som kan bidra till att återupprätta en balans i den inflammerade synovialvätskan: MSC luftkonditionerade medium (CM) minskade produktionen av inflammatoriska mediatorer i OA gemensam bladsticklingar (van Buul et al., 2012).

Di Nicola et al. först bedömde man potentialen för allogen MSC-avstötning i en blandad lymfocytreaktion (MLR). I stället för att framkalla ett immunsvar undertryckte cellerna proliferation av T-celler (Di Nicola et al., 2002; Krampera m.fl., 2003)., Relevansen av MSC-utsöndrade faktorer i immunmodulation visades av deras supernatants kapacitet att avleda immunceller från skadade organ (Parekkadan et al., 2007). För närvarande är MSCs under utvärdering i många kliniska prövningar för många inflammatoriska tillstånd (Trounson och McDonald, 2015).

en av de viktigaste effekterna av MSC-medierad immunsuppression är prostaglandin-E2 (PGE2). PGE2 utsöndras konstitutionellt av MSCs och dess produktion förbättras dramatiskt via stimulering av interferon (IFN)-γ, TNF-α (engelska et al., 2007), eller IL-1β (Chen et al., 2010)., PGE2 påverkar negativt spridningen av T – (Martinet et al., 2009) och natural killer (NK) – celler (Sotiropoulou et al., 2006), orsakar en ökning av poolen av regulatoriska T-celler (Treg), stimulerar makrofager att producera IL-10 och förhindrar monocyter från att differentiera till dendritiska celler (DCs) (Aggarwal och Pittenger, 2005). I OA medierar PGE2 ASC terapeutiska effekter och är en reglerande kontrollpunkt vid immunmodulation. Manfredini et al., bevis på att de PGE2/COX2 vägen är ansvarig för induktion av IL-10 och hämning av TNFa och IL-6 för att framkalla en M2-omkopplaren i mänskliga synovial makrofager (Manferdini et al., 2017).

indoleamin 2,3-dioxygenas (Ido) katalyserar nedbrytningen av tryptofan, vilket orsakar undertryckande av T-celler. Det är anställd av DCs att modulera immunsvar (Mellor och Munn, 2004), men kan vara utsöndras av MSCs på IFN-γ-stimulering (Krampera et al., 2006). I en human MLR var IFN-γ-inducerad uttryck av ido i MSCs ansvarig för undertryckande av T-cellproliferation (Meisel et al., 2004)., Det driver också M2 polarisering i makrofager och inducerar en tolerogenic fenotyp i DCs och Tregs (Ge et al., 2010; Sica och Mantovani, 2012). Dess betydelse för MSC-medierad immunsuppression har validerats med hjälp av specifika hämmare och knockout MSCs (Krampera et al., 2006; engelska et al., 2007; Spaggiari et al., 2008).

TNF-inducerbar gen (TSG)-6 är känd för sina multipla och olika antiinflammatoriska mekanismer (Wisniewski och Vilcek, 2004). Producerad som svar på inflammatoriska signaler har den en central roll i MSC-medierad immunosuppression (Lee et al., 2009)., Å andra sidan identifierades det som en av de mest signifikant uppreglerade generna i humant oa-ledbrusk (Chou et al., 2015) och föreslås som en sjukdom biomarkör, som dess aktivitet i synovialvätska förutspådde oa progression (Wisniewski et al., 2014). TSG-6 har en komplex roll i broskpatologi, eftersom den är involverad i matrismontering under syntes av ny vävnad (Chou et al., 2018).

rollen av apoptotiska MSCs

När de administreras kan MSCs genomgå biologiska förändringar mer radikala än differentiering eller licensiering. Toupet et al., observerade att de flesta MSCs försvinner 10 dagar efter ia-injektion i en murinmodell av OA, med liknande resultat erhållna med syngeneiska och xenogena humana ASCs (Toupet et al., 2013, 2015). Trots död och clearance av administrerade celler observeras signifikanta terapeutiska effekter som svar på ia-injektion av mus-ASC (ter Huurne et al., 2012; Schelbergen et al., 2014).

apoptotiska celler kommunicerar med immunceller genom två olika mekanismer: direkta effekter associerade med apoptotiska celler själva och indirekta effekter som utlöses i fagocytiserande celler (Figur 2)., Direkta effekter inkluderar utsöndring av IL-10 och TGF-β, vilket genererar en immunosuppressiv mikromiljö (Chen et al., 2001; Korns m.fl., 2011). Denna miljö hämmar lipopolysackarid (LPS)-stimulerade makrofager från att utsöndra IL-1β och TNF-α (McDonald et al., 1999). Indirekta effekter är förknippade med eliminering av apoptotiska celler av fagocyter, vilket resulterar i minskad respons på LPS (Perruche et al., 2009) och en övergång till en antiinflammatorisk profil (Fadok et al., 1998)., Immunceller som internaliserar apoptotiska celler misslyckas också med att inducera CD4 + T-hjälparceller, vilket lämnar effektorlymfocyterna i ett” hjälplöst ” tillstånd (Griffith et al. 2007) och framkalla klonat expansion av Foxp3+ regulatoriska t-celler (Xia et al., 2007; Perruche m.fl., 2008).

med en murinmodell av graft-vs.,-host reaktion (GvHD), har forskare visat att infunderas MSC apoptos är orsakad av mottagaren T-celler genom cell-till-cell kontakt med lanseringen av perforin – och granzyme B-innehållande granulat (Galleu et al., 2017). Fagocyter visades också ha en nyckelroll som producerar ido vid uppslukande apoptotiska MSCs. När dessa komponenter slogs ner eller inhiberades förlorades den terapeutiska effekten av MSCs. Viktigast av allt, infusion av MSCs gjorde apoptotiska ex vivo återställda terapeutiska effekter. Intressant är att patientens respons på MSCs korrelerade med deras cytotoxiska kapacitet., Dessa fynd visar att apoptos är en av drivmekanismerna för MSC-medierad immunsuppression.

TGF-β-medierad toleransinduktion är den vanligast rapporterade mekanismen i prekliniska studier av extrakorporeal fotoferes, administrering av leukocyter renderade apoptotisk ex vivo. En stark immunmodulerande effekt observerades vid inflammatorisk artrit (Michlewska et al., 2009, Perruche m.fl., 2009) och fotoferes är en godkänd terapi för kutan T-cellslymfom och GvHD (Weitz et al., 2015)., Apoptos kan också utgöra en viktig del av MSC terapi i OA. Opublicerade data i vårt laboratorium visar så lågt som 1.6% MSC engraftment 3 dagar efter ia administrering av GFP + MSCs i murine oa knän. Fluorescerande celler detekterades inte i någon intilliggande vävnad, inklusive lokala lymfkörtlar. Detta förstärker hypotesen att implanterade celler kan genomgå apoptos och modulera inflammation med efterföljande skydd mot oa-utveckling. Apoptos efter infusion är en övergående händelse, Galleu et al., visade att det efterföljande svaret kan utgöra en omprogrammering av vissa aspekter av värdimmunsystemet (Galleu et al., 2017).

Letar efter ytterligare: extracellulära vesiklar

parakrinverkan av MSCs är inte begränsad till lösliga faktorer. MSCs, liksom många andra celler, har visat sig producera extracellulära vesiklar (ECVs) (Lai et al., 2010), små strukturer inneslutna i en fosfolipid tvåskikt, bär många cytoplasmiska komponenter., ECVs är involverade i intercellulär kommunikation genom horisontell överföring av mRNA och protein och grupperas baserat på storlek, med olika sammansättning och biogenes. Exosomes varierar mellan 40 och 100 nm i diameter. De frigörs konstitutionellt från det sena endosomala facket genom fusion av multivesikulära kroppar med plasmamembranet, men deras produktion kan öka vid cytoskelettaktivering. Exosomer kännetecknas av proteiner som krävs för deras bildning och transport, såsom tetraspaniner, Alix och tumör mottaglighet gen 101., Mikrovesiklar är en heterogen population av ECVs mellan 100 och 1,000 nm som genereras via direkt spirande vid aktivering av en stresssignal, som förändrar membranets fosfolipidbalans och bildar lipidflottar. Mikrovesiklar kännetecknas av membranmarkörer som är specifika för modercellstypen. I prekliniska modeller observerades ECVs ha anti-apoptotiska (Bruno et al., 2012), Anti-fibrotisk (Li et al., 2013), Pro-angiogen (Bian et al., 2014), och antiinflammatoriska effekter (Lee et al., 2012)., MSC-härledda ECVs inducerar generering av Tregs, hämmar proliferation av lymfocyter (Mokarizadeh et al., 2012), makrofager (Zhang et al., 2014), och B-celler (Budoni et al., 2013). Endast ECVs kan emellertid misslyckas med att leverera samma immunmodulerande effekter av föräldraceller, med cell-cellkontakt som fortfarande krävs för att modulera lymfocytproliferation och funktion (Conforti et al., 2014).

MSC-härledda ECVs gav lovande resultat i råttmodeller av osteoporos (Qi et al., 2016) och osteokondral defekt reparation (Zhang et al., 2016). Mer nyligen testades MSC-ECVs i OA-modeller., Exosomer härledda från synovium MSCs och inducerade pluripotenta stamceller dämpade sjukdomspoäng i en collagenasinducerad oa (CIOA) musmodell, genom att främja kondrocytproliferation och migration (Zhu et al., 2017). Exosomer som härrör från synoviala MSCs överexpressiva miR-140-5p inducerade proliferation av kondrocyter in vitro. Vid administrering i en råttmodell av OA sjukdomsprogression och broskdegenerering var signifikant försenad (Tao et al., 2017). Cosenza et al. levererade MSC-ECVs i en CIOA-modell och rapporterade minskad ledskada (Cosenza et al., 2017)., Användningen av MSC-ECVs som terapi för OA skulle ge många fördelar jämfört med cellderivat, vilket undviker oro för eventuella maligna omvandlingar. Det kan emellertid uppstå problem med ECV-produktionen, eftersom de kan behöva skräddarsys för den indikation som ska behandlas. Dessutom är deras tillverkning ännu inte standardiserad för klinisk produktion, vilket är fallet för cellulära produkter.

slutsatser

rapporter som sammanfattas här tyder på betydande potential för användning av MSC eller MSC-CM i OA., In vitro resulterade samkultur av OA-kondrocyter med ASC-CM i NF-kB-medierade cytoprotektiva effekter via förbättrad produktion av kollagen II, hämning av IL-6, TNF och olika MMPs samt uppreglering av IL-10 (Platas et al., 2013). På samma sätt, med hjälp av OA-broskexplanter, visade sig MSC-CM störa NF-kB-vägen för att medla antiinflammatoriska och anti-kataboliska effekter (van Buul et al., 2012). Msc har redan visat sig vara ett värdefullt verktyg för många förhållanden, inklusive akut GvHD (Le Blanc et al., 2008) och multipel skleros (Karussis et al., 2008).,

kliniska fas i-studier har visat säkerheten vid direkt ia-administrering av MSC hos OA-patienter (Centeno et al., 2008; davatchi m.fl., 2011). Under 2012 rapporterades smärtreduktion upp till 6 månader efter injektion av 20-24 miljoner MSCs, med ökad brosktjocklek och minskning av edematösa subkondrala fläckar hos tre av sex patienter (Emadedin et al., 2012). Jo et al., injicerade högre doser av ASC (upp till 10 × 108), vilket ger signifikant förbättrad WOMAC-poäng med en kliniskt meningsfull smärtreduktion och, viktigast av allt, regenererad hyalinartikulär brosk i den mest allvarligt degenererade platsen i knäet (Jo et al., 2014). I ADIPOA-studien förbättrade en enstaka dos på 2 miljoner ASC signifikant smärtnivåer och funktion (Pers et al., 2016).

Sammanfattningsvis kan MSCs agera genom en hit-and-run-mekanism snarare än stabilt gravering i vävnaden., Obduktioner av patienter som fick MSC IV-infusioner under olika förhållanden inom ett år före döden bekräftar att donatormscs normalt inte behålls i värdvävnaden. Detektion av donator-DNA korrelerade inte med graden av felmatchning av HLA eller det kliniska svaret, vilket tyder på att clearance inte är immunmedierad (von Bahr et al., 2012). Celldödens roll vid mediering av de terapeutiska effekterna av MSCs behöver emellertid ytterligare undersökning och fenotypen och aktiviteten hos celler som överlever även under en kort tid vid implantationsplatsen.,

Författarbidrag

PM: bidrog till utvecklingen av konceptet som ligger till grund för översynen, undersökte relevant litteratur och skrev granskningens kropp; SR: bidrog också till begreppet inlämning och hjälpte till med skrivandet; AG: forskade litteraturen om apoptos; JMM: deltog i manuskriptförberedelse, pågående och slutlig granskning av inlämningen; FB: deltog också i manuskriptets uppfattning och granskning.

finansiering

PM finansieras av Science Foundation Ireland genom Cúram (bidrag nr., 13 / RC / 2073) och den irländska Blodtransfusionstjänsten. SR finansieras genom en NUI Galway Hardiman stipendium. JMM och FB av Europeiska Unionen (H2020 PHC16-2015, bidrag nr. 667932; H2020-PHC-2014-2015, bidrag nr. 643809) och av Science Foundation Irland genom Cúram (Bidrag nr. 13/RC/2073).

intressekonflikt uttalande

författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.

bekräftelser

vi vill tacka Maciek Doczyk för att utforma siffrorna.,