Diskussion
Die Agarosegelelektrophorese hat sich als effizienter und effektiver Weg zur Trennung von Nukleinsäuren erwiesen. Die hohe Gelfestigkeit von Agarose ermöglicht die Handhabung von Gelen mit niedrigem Prozentsatz für die Trennung großer DNA-Fragmente. Das Molekularsieben wird durch die Größe der Poren bestimmt, die durch die Bündel von Agarose7 in der Gelmatrix erzeugt werden. Im Allgemeinen ist die Porengröße umso kleiner, je höher die Konzentration von Agarose ist., Traditionelle Agarosegele sind am effektivsten bei der Trennung von DNA-Fragmenten zwischen 100 bp und 25 kb. Um DNA-Fragmente, die größer als 25 kb sind, zu trennen, muss man Impulsfeld-Gel-Elektrophorese verwenden6, bei der Wechselstrom aus zwei verschiedenen Richtungen angelegt wird. Auf diese Weise werden größere DNA-Fragmente durch die Geschwindigkeit getrennt, mit der sie sich mit den Änderungen der Stromrichtung neu orientieren. DNA-Fragmente, die kleiner als 100 bp sind, werden durch Polyacrylamidgelelektrophorese effektiver getrennt., Im Gegensatz zu Agarosegelen wird die Polyacrylamidgelmatrix durch eine chemische Reaktion durch freie Radikale gebildet. Diese dünneren Gele sind von höherer Konzentration, werden vertikal ausgeführt und haben eine bessere Auflösung. In der modernen DNA-Sequenzierung wird Kapillarelektrophorese verwendet, wobei Kapillarröhrchen mit einer Gelmatrix gefüllt sind. Die Verwendung von Kapillarröhren ermöglicht die Anwendung hoher Spannungen, wodurch die Trennung von DNA-Fragmenten (und die Bestimmung der DNA-Sequenz) schnell ermöglicht wird.
Agarose kann modifiziert werden, um niedrig schmelzende Agarose durch Hydroxyethylierung zu erzeugen., Niedrigschmelzende Agarose wird im Allgemeinen verwendet, wenn die Isolierung von getrennten DNA-Fragmenten erwünscht ist. Hydroxyethylierung verringert die Verpackungsdichte der Agarosebündel und verringert effektiv ihre Porengröße8. Dies bedeutet, dass es länger dauert, bis sich ein DNA-Fragment gleicher Größe im Gegensatz zu einem Standard-Agarosegel durch ein niedrigschmelzendes Agarosegel bewegt. Da die Bündel durch nicht kovalente Wechselwirkungen miteinander assoziieren9, ist es möglich, ein Agarosegel nach dem Aufsetzen wieder zu schmelzen.
EtBr ist das am häufigsten verwendete Reagenz zum Färben von DNA in Agarosegelen10., Bei Einwirkung von UV-Licht werden Elektronen im aromatischen Ring des Ethidiummoleküls aktiviert, was zur Freisetzung von Energie (Licht) führt, wenn die Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. EtBr arbeitet, indem es sich konzentrationsabhängig im DNA-Molekül interkaliert. Dies ermöglicht eine Schätzung der DNA-Menge in einem bestimmten DNA-Band basierend auf seiner Intensität. Aufgrund seiner positiven Ladung reduziert die Verwendung von EtBr die DNA-Migrationsrate um 15%. EtBr ist ein verdächtiges Mutagen und Karzinogen, daher muss man beim Umgang mit Agarosegelen, die es enthalten, vorsichtig sein., Darüber hinaus gilt EtBr als gefährlicher Abfall und muss entsprechend entsorgt werden. Alternative Flecken für DNA in Agarosegelen sind SYBR Gold, SYBR Grün, Kristallviolett und Methylblau. Von diesen erfordern Methylblau und Kristallviolett keine Exposition des Gels gegenüber UV-Licht zur Visualisierung von DNA-Bändern, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Mutation verringert wird, wenn eine Wiederherstellung des DNA-Fragments aus dem Gel erwünscht ist. Ihre Empfindlichkeiten sind jedoch geringer als die von EtBr., SYBR Gold und SYBR Green sind beide hochempfindliche, UV-abhängige Farbstoffe mit geringerer Toxizität als EtBr, aber sie sind erheblich teurer. Darüber hinaus können alle alternativen Farbstoffe entweder nicht gut sein oder nicht gut funktionieren, wenn sie direkt in das Gel gegeben werden, daher muss das Gel nach der Elektrophorese nachgefärbt werden. Aufgrund der Kosten, Benutzerfreundlichkeit und Empfindlichkeit bleibt EtBr für viele Forscher immer noch der Farbstoff der Wahl. In bestimmten Situationen, z. B. wenn die Entsorgung gefährlicher Abfälle schwierig ist oder junge Studenten ein Experiment durchführen, kann jedoch ein weniger giftiger Farbstoff bevorzugt werden.,
Die in der Gelelektrophorese verwendeten Farbstoffe dienen drei Hauptzwecken. Zuerst fügen sie der Probe Dichte hinzu und lassen sie in das Gel sinken. Zweitens liefern die Farbstoffe Farbe und vereinfachen den Ladevorgang. Schließlich bewegen sich die Farbstoffe mit Standardraten durch das Gel, was die Abschätzung der Entfernung ermöglicht, die DNA-Fragmente migriert haben.
Die genaue Größe der abgetrennten DNA-Fragmente kann durch Plotten des Protokolls des Molekulargewichts für die verschiedenen Bänder eines DNA-Standards gegen die von jedem Band zurückgelegte Strecke bestimmt werden., Der DNA-Standard enthält eine Mischung von DNA-Fragmenten vorbestimmter Größe, die mit den unbekannten DNA-Proben verglichen werden können. Es ist wichtig zu beachten, dass sich verschiedene Formen von DNA mit unterschiedlichen Raten durch das Gel bewegen. Supercoiled Plasmid-DNA bewegt sich aufgrund ihrer kompakten Konformation am schnellsten durch das Gel, gefolgt von einem linearen DNA-Fragment gleicher Größe, wobei die offene kreisförmige Form am langsamsten verläuft.,
Zusammenfassend hat es sich seit der Einführung von Agarosegelen in den 1970er Jahren zur Trennung von DNA als eine der nützlichsten und vielseitigsten Techniken in der biowissenschaftlichen Forschung erwiesen.