patronen van celcyclus Checkpoint deregulering geassocieerd met intrinsieke moleculaire subtypes van humane borstkankercellen

de decatenatie G2 checkpoint is verminderd in lumbale borstkankercellijnen

om de G2/M checkpointfunctie te beoordelen, werd een Mer-test gebruikt met twee topo II-remmers die verschillende werkingsmechanismen vertonen om de G2-M transitiesnelheid te controleren., Cellen werden geïncubeerd met colcemid (om mitotische uitgang te voorkomen) gedurende 2-6 uur in de aanwezigheid of afwezigheid van de topo II katalytische remmer ICRF-193 (die niet openlijk schade aan DNA) om decatenatie G2 checkpoint functie of de topo II poison etoposide (die DNA-schade induceert) om DNA-schade G2 checkpoint functie te meten bij concentraties die 98-100% van normale menselijke diploïde fibroblasten (NHF1-hTERTs) en vereeuwigde lymfoblasten in G2 arresteren.,36 het gebruik van colcemid in de mer-analyse blokkeert cellen van het verlaten van mitose, die voor een strikt onderzoek van de overgang van G2 naar M toestaan, waarbij om het even welke verstorende gevolgen met betrekking tot het tarief van mitotic uitgang worden geminimaliseerd. De MER werd berekend uit Het lineaire gedeelte van de resulterende lijn (2-6 uur tijdpunten) en wordt uitgedrukt als het percentage cellen dat per uur mitose binnengaat.36

Mer voorbeelden worden getoond voor de HMEC cellijn R-HMEC-E in het linkerpaneel van Fig 2a., Deze cellen geaccumuleerd in mitose wanneer geïncubeerd in colcemid (en de Vehicle control dimethylsulfoxide (DMSO), gesloten vierkanten) die hun overgang van G2 naar M weerspiegelen; nochtans, in aanwezigheid van de katalytische inhibitor ICRF-193 (open cirkels), werd de mitotische accumulatie van R-HMEC-e cellen ernstig geremd die suggereren dat de meerderheid van deze cellen een decatenation G2 checkpointrespons activeren., In aanwezigheid van het topo II GIF etoposide, werd de mitotische accumulatie van R-HMEC-e cellen ook ernstig geremd( gesloten driehoeken), wat erop wijst dat deze cellijn een effectieve DNA-schade G2 checkpoint vertoont. Omgekeerd, bleef de cellijn MDA-MB-453 van de Lumbborst in mitose in aanwezigheid van ICRF-193 accumuleren, maar niet etoposide (Fig. 2a, rechterpaneel), die suggereren dat een meerderheid van deze cellen de decatenation G2 checkpoint ontweken maar gearresteerd in G2 op DNA-schade.

alle 24 cellijnen werden onderworpen aan de mer-gebaseerde G2 checkpoint assay en de gemiddelden van drie onafhankelijke experimenten voor elke cellijn (gegroepeerd volgens moleculair subtype) zijn weergegeven in Fig. 2b (individuele cellijngemiddelden ± SEM worden gegeven in Tabel S1)., Zoals verwacht, vertoonden alle vier positieve controle HMEC cellijnen ernstige Mer remming in reactie op ICRF-193 wat suggereert dat deze klasse een effectieve decatenatie G2 checkpoint vertoont. In tegenstelling, controlepunt functies van de borstkankercellijnen waren zeer variabel (Fig. 2b). Bij het groeperen van de cellijnen door intrinsiek moleculair subtype, bleken de LumB en BL cellijnen verzwakte decatenation G2 checkpoint functie vertonen, terwijl de her2e en CL subtypes checkpoint functie vergelijkbaar met de HMECs., Een reeks statistische lineaire gemengde modellen (LMM ‘ s) werd gebruikt om G2-controlepostfuncties tussen de verschillende subtypes te vergelijken (zie aanvullende informatie (SI)). Uit deze analyses bleek dat de LumB-klasse (maar niet de BL-klasse) van borstkankercellijnen defecten vertoonde in decatenatie G2-checkpointfunctie (**p < 0,05, FDR < 0,05)., Hoewel de verdeling van % remming van MER in de bl-cellijnen aanvankelijk vergelijkbaar leek met die van de LumB-groep, bleek bij nadere inspectie van de mer-gegevens dat de bl-groep zeer lage MERs vertoonde in afwezigheid van een topo II-katalytische remmer, wat erop wijst dat deze groep niet reageerde op colcemid-behandeling; dus lijkt het percentage remming van MER kunstmatig laag in de BL-groep.,

aanvullende experimenten werden uitgevoerd om te beoordelen of borstkankercellijnen in staat waren om de DNA-schade G2 controlepost te activeren met behulp van een concentratie van het topo II GIF etoposide equivalent aan die van de katalytische remmer ICRF-193 (4 µM). Alle vier HMEC cellijnen vertoonden een effectieve DNA-schade G2 checkpoint in reactie op etoposide (Fig. 2c)., De meerderheid van de cellijnen van borstkanker vertoonde ook grote Mer-remming in aanwezigheid van etoposide en er werden geen significante verschillen waargenomen voor om het even welk van de klassen van de cellijn van borstkanker; aldus, konden deze cellijnen van borstkanker de controlepost van DNA-schade G2 activeren bij niveaus vergelijkbaar met die van HMECs, met uitzondering van de lumbale lijn van D4475 (tabel S1).,

om te bevestigen dat ICRF-193 in staat was de topo II-activiteit in de lumbale cellijnen te remmen, werden cytogenetische preparaten onderzocht in aanwezigheid of afwezigheid van ICRF-193 en representatieve metafasen van twee lumbale cellijnen worden weergegeven in Fig. 2d. in aanwezigheid van DMSO, de meerderheid van de lumbale metafasen tentoongesteld geïndividualiseerde gecondenseerde chromosomen. Echter, bij remming van topo II met ICRF-193, vertoonde >88% van alle Lumb mitotische cellen chromosomen die ondercondenseerd en/of verstrikt waren (gegevens niet getoond)., Het waargenomen defect in decatenatie G2 checkpoint functie was dus waarschijnlijk niet het resultaat van een falen van ICRF-193 om topo II katalytische activiteit in de lumbale klasse te remmen, wat de conclusie ondersteunt dat het defect te wijten is aan disfunctionele checkpoint activering en niet een onvermogen van de lumbale klasse om te reageren op de icrf-193 behandeling.

eerdere studies tonen aan dat p53 wordt geactiveerd als reactie op ICRF-193 en dat cellijnen met defecte decatenatie G2-checkpointfunctie een verzwakte activering van p53 vertonen.,36, 37 daarom, werden de LumB en HMEC klassen onderzocht om te bepalen of cellijnen die een decatenation G2 checkpoint ontberen verzwakte p53 phosphorylation vertonen. Om vergelijkingen tussen verschillende blots te vergemakkelijken en rekening te houden met blootstellingsverschillen, werd hetzelfde nhf1-hTERT-monster op elke gel geladen en werd de toename van de activering van p-Ser15 p53 voor elke cellijn genormaliseerd tot die van de nhf1-hTERT interne controle. Zoals weergegeven in het bovenste paneel van Fig. 2e, alle vier HMEC cellijnen reageerden op ICRF-193 met inductie van totaal p53 en p-Ser15 p53., Grotere toenames in p-Ser15-p53 werden waargenomen bij etoposide behandeling in de meerderheid van de HMEC cellijnen, wat betekent dat de activering van p53 die door ICRF-193 in HMECs wordt gesignaleerd vergelijkbaar is met die waargenomen in andere niet-tumorigene cellijnen.36 in tegenstelling, vertoonden de lumbale cellijnen verzwakte inductie van p-Ser15 p53 in reactie op ICRF-193 (Fig. 2e, Onderpaneel). Ten minste twee van deze cellijnen (HCC1428 en MDA-MB-453) leken lage of niet-detecteerbare niveaus van p53 uit te drukken ondanks het herbergen van wildtype TP53 genen.,38 alleen de cellijn MDA-MB-415 vertoonde een mutantvorm (Y236C) en hoge basale niveaus van p53, wat suggereert dat p53-activering werd verzwakt door een mechanisme anders dan mutatie in de meeste Lumblijnen. De toename van p-Ser15 p53 bij etoposidebehandeling voor de LumB-klasse was statistisch niet verschillend van de HMEC-klasse (Fig. S1B), die suggereren dat het verzwakte signaleren niet toe te schrijven was aan het verlies van een inherente capaciteit aan phosphorylate Ser15 van p53, maar eerder minder ontvankelijk was voor TOPO II katalytische remming.,

activering van P-Ser 1981 van ATM en p-Thr 68 van Chk2 kan bijdragen tot de activering van P-Ser15 van p53 en is ook waargenomen bij blootstelling aan icrf-193; 36 er werden echter geen significante verschillen in activering van ATM of Chk2 waargenomen in de Lumbklasse in vergelijking met de HMEC-klasse, waarschijnlijk als gevolg van hoge niveaus van variatie tussen cellijnen (Fig. S1A-B). De westelijke vlekken van alle cellijnen die de resterende intrinsieke subtypes omvatten worden getoond in Fig. S1C-G., Geen van de intrinsieke subtypes vertoonde een statistisch significante afname van ATM of Chk2 in vergelijking met de HMEC-klasse bij blootstelling aan ICRF-193 of etoposide (Fig. S1B); echter, de Her2E klasse vertoonde ook verzwakte activering van p53 in reactie op ICRF-193. Vanwege de korte Blootstellingstijd (3 uur) kan dit het gevolg zijn van de tragere groeisnelheid van de Her2E-lijnen zoals hieronder beschreven. Samen geven deze resultaten aan dat de lumbale klasse een defecte decatenatie G2 checkpoint herbergt.,

Borstkankercellijnen vertonen gewijzigde progressie van de S/G2/M-celcyclus

tijdens het initiële G2 / M-controlepuntscherm vertoonden verscheidene cellijnen een lage MER (tabel S1)., Omdat de interpretatie van checkpoint functie kan verward worden door differentiële groei van de cel lijn paneel werd beoordeeld voor verschillende patronen van celproliferatie en/of geliberaliseerde celcyclus kinetiek om rekening te houden met onderlinge verschillen in de cel cyclus fase lengte die kunnen interfereren met de interpretatie van de G2/M checkpoint functionaliteit experimenten en om ervoor te zorgen dat de LumB gebrek in decatenation G2 checkpoint functie was niet te wijten aan de inherente verschillen in het MER., Dergelijke verstorende effecten zijn eerder gemeld en zijn vaak te wijten aan de afhankelijkheid van sommige Checkpoint assays op enkelvoudige markers van celproliferatie.36

drie maten van celproliferatie werden vergeleken via flowcytometrie, waaronder de S-fasefractie zoals bepaald door Edu-incorporatie (S), de mitotische index (MI) zoals gemeten door MPM2+/4N DNA-gehalte, en de MER., Het aantal populatieverdubbelingen (PDL ‘ s) die tijdens continue cultuur voorkomen, werd ook bepaald door het totale aantal cellen tijdens elke passage te tellen en de verdubbelingstijd van elke cellijn (PDL/week) te berekenen. In Fig. 3 a-d, worden de individuele gemiddelden voor elke cellijn afgebeeld en gegroepeerd per moleculair subtype. (Gemiddelden voor elke cellijn ± SEM worden gegeven in Tabel S2).

in Fig. 3a, de S-fase fracties van de her2e en LumB subtypes leken lager dan de andere klassen., LMM-analyse ondersteunde de waarneming van een afname in S voor de Her2E-klasse, maar de afname in Lumblijnen was niet statistisch significant wat suggereert dat de HMEC -, BL -, CL-en Lumbelklassen vergelijkbare percentages cellen vertonen die DNA-replicatie ondergaan. In Fig. 3b, vertoonden de bl cellijnen een verhoogd MI in vergelijking met de HMECs, en de LMM-analyse versterkte deze observatie die voorstelt dat de HMEC, CL, LumB, en Her2E klassen gelijkaardige MIs vertonen. In Fig., 3c, de MER van de bl -, CL-en Her2E-klassen waren lager dan de HMEC-Klasse; deze waarnemingen werden bevestigd door LMM-analyse en suggereren dat alleen de HMEC-en LumB-klassen vergelijkbare Mer ‘ s vertoonden. In Fig. 3d, PDL metingen suggereerden dat de LumB en Her2E subtypes lagere PDL ’s hebben, en LMM analyse gevalideerd dat beide klassen aanzienlijk lagere PDL’ s tentoongesteld in vergelijking met de HMEC klasse., De lumbale klasse was vergelijkbaar met de HMEC klasse door elke andere maat van celproliferatie, wat erop wijst dat een MER Vergelijking van de HMEC en lumbale klassen een geschikte maat was voor zowel decatenatie als DNA-schade G2 checkpointfunctie in lumbale cellijnen. (**p < 0,05, FDR < 0,05)

omdat de voltooiing van DNA-replicatie gekoppeld is aan het begin van mitose, neemt gelijktijdige toename van meerdere maten van celproliferatie (Fig., 3a-c) zal naar verwachting optreden in cellen die een strikte regulerende controle over de progressie van de S/G2/M-celcyclus handhaven om een diploïde genoom te behouden.39, 40 omgekeerd, zou deze verhouding worden verstoord als de faseovergangen van de celcyclus werden gedereguleerd. Aldus, werden twee aangrenzende markers van de fase van de celcyclus beoordeeld voor de aanwezigheid van een correlatieve relatie,41 en een afwezigheid van correlatie tussen die markers zou impliceren dat de overgang tussen die twee fasen van de celcyclus werd vertraagd en/of aberrantly geregeld.,

De HMEC-en LumB-klassen vertoonden een sterk correlatieve relatie tussen de S-fasefractie en MI (p < 0,0001 respectievelijk 0,0041, Tabel 1), wat suggereert dat de overgangen van de celcyclus tussen de S/G2/M-fasen een geordende progressie volgen. Nochtans, vertoonden de klassen BL, CL, en Her2E geen correlatief verband tussen de fasefractie van s en MI die suggereren dat de vooruitgang van de celcyclus op enig punt tussen de initiatie van de replicatie van DNA en mitotic uitgang wordt vertraagd of aberrantly geregeld., Om het gedereguleerde punt(en) in de celcyclus verder te verfijnen, werd de S-fasefractie vergeleken met de mer-meting om te bepalen of de progressie van S of G2 vertraagd was. Alleen de HMEC-klasse (p = 0,0006) vertoonde een correlatie tussen de s en MER; alle klassen van de borstkankercellijnen vertoonden ontkoppeling van de S-fasefractie en MER, wat suggereert dat deze klassen langere perioden in de S-of G2-fasen kunnen doorbrengen, of afwijkende controle van de celcyclus tijdens S/G2 kunnen vertonen., Ten slotte vertoonden de HMEC -, LumB-en CL-klassen allemaal een correlatieve relatie tussen de tijdsafhankelijke MER en MI (p = 0,012, p < 0,0001, en P = 0,0051, respectievelijk) wat suggereert dat deze klassen geordende mitotische progressie behouden. Daarentegen vertoonden de bl-en Her2E-klassen geen significante correlatie tussen MER en MI, wat erop wijst dat deze klassen mogelijk niet reageren op de colcemide-remmer van de microtubulepolymerisatie en/of moeite hebben met het voltooien van de mitose. (*p < 0,05, * * p < 0.,05, FDR < 0.05)

Alleen de niet-tumorigenic HMEC klasse toonde een correlatieve relatie tussen alle drie de proliferatie markers, te suggereren dat de regulatie van de cel cyclus in HMECs is gekoppeld, komt voor in een geordende progressie, en illustreert het strak gestuurde regeling van de S/G2/M progressie kinetics in niet-tumorigenic cellen., In tegenstelling, vertoonden de cellijnen van borstkanker deregulering van één of meer verschillende fasen van de celcyclus die suggereren dat de vooruitgang van S/G2/M vertraagd of veranderd was. De klassen BL en Her2E toonden geen correlatieve relaties, die suggereren dat veelvoudige tekorten in de verordening van de celcyclus aanwezig waren. Omdat de gegevens in Fig. 3A-d tonen aan dat de her2e-klasse ook lagere proliferatiepercentages in cultuur vertoonde in vergelijking met de HMECs, zijn wij terughoudend om conclusies te maken met betrekking tot de functie van het controlepunt van de celcyclus in cellijnen van de her2e-klasse zonder aanvullende gegevens., Samengevat suggereren deze gegevens dat de subtypes van borstkanker geassocieerd zijn met een gewijzigde regulering van de progressie van S/G2/M, en dat de bl-en CL-klassen progressiedefecten van s/G2/M kunnen vertonen die de detectie door de mer-test ontweken.,

CL-en BL-borstkankercellijnen vertonen chromatidecohesiedefecten; de SAC is aangetast in bl-borstkankercellijnen

om te bepalen of de bl-en CL-klassen s/G2 / M-checkpointdefecten vertoonden die niet door het MER-scherm werden geïdentificeerd, werden metafasen geanalyseerd om grove chromosomale structuurafwijkingen te evalueren die vaak wijzen op checkpointdefecten. Alle metafasen werden op een blinde manier gescoord, en voorbeeld spreads worden weergegeven in Fig. 4a voor een HMEC, BL, en CL cellijn., Over het geheel genomen vertoonden metafasen van de LumB-en Her2E-klassen vergelijkbare kansen op het herbergen van een cohesiefout in vergelijking met de HMEC-klasse (tabel S3A, p = 0,1674 en P = 0,4743, respectievelijk). In tegenstelling, de CL en BL klassen bleek een verhoogde kans op het herbergen van cohesie defecten die varieerden van mild tot ernstig vertonen (Fig. 4a).

Door de variabele bereik van cohesie gebrek ernst, metaphases werden onderzocht via een hoge gevoeligheid fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) assay met behulp van een sonde gericht op het centromeer van chromosoom 9 (CEP9) om te bevestigen dat de aanwezigheid van samenhang gebreken en het evalueren van de ernst van de BL en CL-klassen., In diploïde metafasecellen met goed samenhangende zusterchromatiden liggen de centromeren van de zusterchromatiden zo dicht bij elkaar dat ze een enkele CEP9-locus lijken te zijn bij VISKLEURING. In cellen die cohesiefouten vertonen, worden de centromere gebieden van de zusterchromatiden echter gescheiden en vertonen zij een doubletpatroon dat twee visueel verschillende cep9-loci bevat. Graden van cohesiedefecten werden gedefinieerd als licht, matig of ernstig, 42 en voorbeelden worden weergegeven in Fig. 4b met witte pijlen die elk type cohesiefout aangeven., De klassen BL en CL toonden beide verhogingen van het totale percentage cellen met cohesiedefecten, die suggereren dat deze klassen moeilijkheid kunnen ervaren het voltooien van DNA-replicatie en/of het verdelen van zusterchromatiden gelijk in dochtercellen. Bovendien verschilden de verdelingen van de ernst van het cohesiefout in beide klassen ook in vergelijking met de HMECs, wat erop wijst dat in deze klassen een groter aantal matige/ernstige cohesiefouten werd gevonden (Fig. 4b, Onderpaneel)., Bovendien vertoonden zowel de bl-als de CL-klasse significant hogere percentages cellen met aneuploïdie in vergelijking met HMECs (>4 CEP9-foci per metafase), hetgeen erop wijst dat cohesiefouten kunnen leiden tot ongepaste segregatie van duplicaatchromosomen tijdens cytokinesie en de aanwezigheid van genomische instabiliteit in deze klassen bevestigt (Fig. S2 en tabel S3B).

omdat de mer ‘ s van de CL-en BL-klassen laag waren in vergelijking met de HMEC-klasse (Fig. 3c), de aanwezigheid van cohesie gebreken (Fig., 4a, b) zijn eerder aangetoond dat de SAC activeren,43 en ernstige aneuploïdie werd waargenomen in beide klassen (tabel S5B, Fig. S2), was het mogelijk dat de bl en CL klassen SAC defecten hadden. Aldus, werd het aantal mitotic cellen die over een periode van 24 h in aanwezigheid/afwezigheid van colcemid geaccumuleerd gemeten door cytometry stroom.,19, 44 deze analyse staat ons toe om tussen cellijnen te onderscheiden die een lage Mer vertonen toe te schrijven aan langzame beweging door s en/of G2 fase (merkbare niveaus van mitotic accumulatie in aanwezigheid van colcemid verschijnen meer dan 24 h) en cellijnen die een functionele zak missen (geen mitotic accumulatie toe te schrijven aan een onvermogen om in colcemid te arresteren). De cytometry profielen van de voorbeeldstroom voor MCF10As (HMEC) en MDA-MB-468s (BL) worden getoond in het linkerpaneel van Fig. 4 quater., De toevoeging van 100 ng/mL colcemid verhoogde dramatisch het aantal mitotische cellen in MCF10As, terwijl het aantal mitotische cellen in MDA-MB-468s (Fig. 4C, middenpanelen). De gemiddelde toename van mitotische index voor elke cellijn gegroepeerd per intrinsiek moleculair subtype wordt getoond voor drie onafhankelijke experimenten (rechterpaneel, Fig. 4c). Individuele cellijngemiddelden worden gegeven in Tabel S4. Zowel de bl-als de Her2E-klasse bleken een defecte SAC te vertonen en de LMM-analyse bevestigde dat de SAC-functie in de bl-klasse was verminderd., Hoewel één BL-cellijn (SUM149) wat mitotic accumulatie in aanwezigheid van colcemid vertoonde, is dit resultaat waarschijnlijk toe te schrijven aan de aanwezigheid van een subpopulatie van CL cellen die in deze cellijn worden gevonden.In totaal suggereren deze gegevens dat de gecombineerde cohesiefouten en afwijkende SAC-functie die in de BL-klasse zijn vastgesteld, kunnen bijdragen tot de hoge niveaus van genomische instabiliteit die bij BL-borstkanker zijn waargenomen., De aanwezigheid van een effectieve SAC in de CL-klasse suggereert dat cohesiefouten in deze cellijnen de SAC kunnen activeren en dat de waargenomen ernstige aneuploïdie waarschijnlijk te wijten is aan een alternatief mechanisme van genomische instabiliteit. (*p < 0,05, * * p < 0,05, FDR < 0.,05)

A decatenatie G2 checkpoint genexpressie handtekening correleert met klinische resultaten van borstkankerpatiënten

om te bepalen of de checkpoint defecten geïdentificeerd in de cellijn panel waren geassocieerd met klinische resultaten, werd een genexpressie handtekening van decatenatie G2 checkpoint functie geïdentificeerd uit de cellijn panel met behulp van kwantitatieve trait analyse (Qta) (tabel S5)., Deze handtekening werd toegepast op de metabric klinische gegevensreeks, die ongeveer 2000 steekproeven van de borsttumor bevat die klinische annotaties, intrinsieke moleculaire subtypinginformatie, en de gegevens van de genuitdrukking omvatten.In een univariate analyse werd de decatenatie G2 checkpoint signatuur significant geassocieerd met een betere algehele overleving in alle borsttumoren (HR: 0,7391, CI: 0,5759–0,9486, log rank p = 0,0176, Fig. 5a). In een multivariate analyse met inbegrip van de intrinsieke moleculaire subtypes, was de signatuur van het controlepunt niet significant geassocieerd met de totale overleving (HR: 0.,76843, CI: 0,5769-1,023, log rang p = 0,071673), maar was bijna significant.

De decatenatie G2 checkpoint signature was ook voorspellend voor OS uitkomsten bij Luma patiënten (HR: 0,6039, BI: 0,4559–0,7998, P = 0,01741, Fig. 5b), wat suggereert dat verminderde decatenatie G2 checkpoint functie kan bijdragen aan slechte resultaten in het Luma subtype. De mediane decatenatie G2 checkpoint handtekening voor alle borsttumoren varieerde tussen de subtypes (p = 1,73 e-133, Fig., 5c) met het LumB–subtype dat de laagste mediane controlepunthandtekening uitdrukt; deze waarneming werd onafhankelijk geverifieerd met behulp van de UNC337-gegevensverzameling (p = 8,46 e-20, tabel S6).Hoewel de decatenatie G2 checkpoint signature niet significant geassocieerd was met uitkomsten binnen het LumB subtype (P = 0,597, tabel S6), kan dit te wijten zijn aan de inherent lage mediane decatenatie G2 checkpoint signature binnen dit subtype., Bijvoorbeeld, als de meerderheid van LumB tumoren zijn defect voor decatenation G2 checkpoint functie, kan er niet genoeg variatie van de handtekening binnen het LumB subtype om resultaten te voorspellen. Al met al impliceren deze gegevens dat het decatenatie-G2-controlepunt een klinisch relevant doelwit kan zijn voor de behandeling van Luma-en/of Lumbastankerpatiënten.