grenzen in bio-engineering en biotechnologie

mesenchymale stromale cellen

sinds beschreven door Friedenstein (Friedenstein et al., 1966), mesenchymale stam/stromale cellen (MSCS) zijn de focus van onderzoeksinspanningen geweest om hun therapeutisch potentieel te exploiteren. Vanwege hun immuun-ontwijkende aard, MSCS vrij immunomodulerende factoren die hen in staat stellen om afstotingsmechanismen te ontsnappen voor voldoende tijd om hun therapeutische werking uit te oefenen (Ankrum et al.,, 2014). MSCs drukt ook een verscheidenheid van cytokine en chemokine receptoren uit, zoals CXCR4, CXCR7, en CCR7, die migratie naar plaatsen van verwonding en ontsteking toelaten (Sasaki et al., 2008; Liu et al., 2012).

als paradigma voor weefselregeneratie zijn MSc ‘ s gebruikt voor vele orthopedische aandoeningen, waaronder osteoartritis (OA). Bij de eerste succesvolle behandeling werd gebruik gemaakt van een caprien model van OA waarbij voorste kruisbanddoorsnede gecombineerd werd met totale mediale Meniscectomie (Murphy et al., 2003)., Directe intra-articulaire (IA) levering van autologe beenmerg (BM)-MSCs, 6 weken na verwonding, leidde tot meniscale reparatie en Chondro-bescherming. De groene fluorescente proteã ne (GFP)-getransduced cellen waren detecteerbaar in de synovial capsule, vet stootkussen en pas-gevormde meniscus, maar niet in gewrichtskraakbeen. Dit werk leidde tot de hypothese dat MSCs handelen via alternatieve mechanismen voor celvervanging dwz, trofische mechanismen om weefselregeneratie te bevorderen door modulatie van de gastheeromgeving en/of stimulatie van endogene voorlopercellen (Jeong et al., 2013)., De studie werd vervolgens gevalideerd in andere preklinische modellen van OA (Barry and Murphy, 2013). In het algemeen, dit fenomeen transfers naar andere ziekte scenario ‘ s, zoals uitgebreid beoordeeld door Prockop et al. (Prockop, 2009). Meer recent, Fase I proeven hebben bewijsmateriaal verstrekt dat MSCs ook klinisch nut in het moduleren van OA (Jo et al., 2014; Pers et al., 2016); een aantal niet-gepubliceerde Fase 2-Studies zijn bezig met de beoordeling van adipose-afgeleide MSC ‘ s bij OA, waaronder ADIPOA2 (http://adipoa2.eu/).,

MSC ‘ s verdwijnen snel na toediening uit het doelweefsel, maar zijn nog steeds in staat om chondroprotectieve en immunomodulerende effecten te leveren (ter Huurne et al., 2012). Aangezien hun therapeutische werking onafhankelijk lijkt te zijn van hun engraftment, wordt het nu beschouwd als voornamelijk paracriene-gemedieerd. Het steeds meer geaccepteerde model is dat MSCs slapend in vivo worden gevonden Als pericytes (Crisan et al., 2008). Deze nemen deel aan de ontwikkeling van weefsels, waaronder synovium, en zijn betrokken bij weefselherstel tijdens het volwassen leven (Roelofs et al., 2017)., Eenmaal geactiveerd in reactie op signalen in verband met de gewonde omgeving, zoals pro-inflammatoire cytokines, een fenomeen dat algemeen wordt aangeduid als “licentie”, scheiden ze factoren af, waaronder chemokines en cytokines, om een regeneratieve omgeving tot stand te brengen. Afhankelijk van de omgeving van de specifieke ziekte kunnen anti-apoptotische en anti-fibrotische factoren de mate van schade beperken om de weefselheling te verbeteren (Ryan et al., 2017). Weefsel-intrinsieke voorouderdieren worden gevraagd om zich te vermenigvuldigen en te differentiëren, terwijl chemoattractants endogene voorouderdieren aan de plaats van verwonding rekruteren., Gelijktijdig, kunnen geactiveerde MSCs de immune reactie lokaal moduleren door selectief de proliferatie van immune cellen te remmen (Aggarwal en Pittenger, 2005) (figuur 1). Deze paper zal het bewijs voor deze therapeutische effecten in modellen die relevant zijn voor OA, in vivo of in vitro (samengevat in Tabel 1) te beoordelen. Het zal in de toekomst van cruciaal belang zijn om deze bevindingen te valideren met behulp van vers geà soleerde stromale cellen.

het MSC-Secretoom

toont een rijk secretieprofiel dat wordt versterkt door blootstelling aan ontstekingssignalen. Een proteomicsbenadering identificeerde 118 proteã nen differentieel uitgedrukt door menselijke adipose-afgeleide stamcellen (ASCs) op tumornecrosefactor (TNF)-α stimulatie (Lee et al., 2010)., Deze omvatten vele cytokines en chemokines , proteasen en proteaseremmers , extracellulaire matrijsmolecules (ECM) en factoren betrokken bij immune regelgeving en cel het signaleren.

apoptose

Chondrocyte apoptose is al vele jaren geassocieerd met degeneratieve OA (Aigner et al., 2004; Del Carlo en Loeser, 2008)., Hoewel er geen meldingen zijn van directe anti-apoptotische effecten van MSCs in de context van OA, suggereert indirect bewijs dat exosomen verkregen uit humane MSCs, en door gevolgtrekking bestaande uit secretiefactoren, IL-1β-geïnduceerde apoptose van ex vivo gekweekte oa chondrocyten (Liu et al., 2018a). Bovendien bevorderden MSc-afgeleide exosomen de proliferatie van chondrocyten in een ratmodel van OA, door Mir-206 met lncRNA-KLF3-AS1 (Liu et al., 2018b)., Ondanks oplosbare factoren werden niet getoond in modellen van OA, MSCS reageerde op twee verschillende apoptotische cellijnen in vitro door verhoogde expressie en secretie van het anti-apoptotische hormoon stanniocalcin (STC)-1 (Block et al., 2009). Toekomstige werkzaamheden met betrekking tot joint-associated MSc anti-apoptotische effecten zullen waarschijnlijk directe bemiddelaars van het proces identificeren.

fibrose

Maumus et al. co-gecultiveerde autologe ASCs met chondrocyten afgeleid van OA patiënten in een transwell systeem (Maumus et al., 2013)., De auteurs merkten duidelijke dalingen in expressieniveaus van hypertrofische en fibrotische markers MMP-13, alkalische fosfatase, Runx2, collagenen type I, III, VI en vimentin, evenals een 40% toename in TGF-β1 secretie. Door een neutraliserend antilichaam te gebruiken, werd HGF geïdentificeerd als de belangrijkste mediator van het anti-fibrotische effect. Deze gegevens zijn van bijzonder belang aangezien de HGF-concentratie in synoviale vloeistof een directe correlatie heeft met de ernst van OA (Dankbar et al., 2007). MSCs remmen ook fibrose in vivo via bFGF (Suga et al., 2009) en adrenomedullin (Li et al., 2009)., Daarnaast stelde een aantal studies voor dat in vivo toegediende MSCs TSG-6 afscheidde en indirect fibrose voorkwam door de vroege ontstekingsreactie op andere ziekten dan OA, waaronder myocardinfarct (Lee et al., 2009), peritonitis (Choi et al., 2011), ontsteking van het hoornvlies (Oh et al., 2010), en de afstoting van het hoornvlies allograft (Oh et al., 2012).

weefselmetabolisme

MMP ‘ s breken onder andere ECM af en worden gereguleerd door specifieke remmers die TIMPs worden genoemd., Bij OA wordt de balans tussen anabole en katabole factoren verstoord ten gunste van de laatste (Lohmander et al., 1993). MMP-2, -9, en -13 werden gedetecteerd op hogere niveaus in humaan OA kraakbeen in vergelijking met gezond weefsel (Jackson et al., 2014). Verder correleerde de afname van MMP-13 met een verbeterd osteochondraal herstel bij ratten behandeld met doxycycline (Lee H. et al., 2013) en MSCS scheiden constitutief hoge niveaus van TIMP-2 en -1 af, die respectievelijk MMP-2 en MMP-9 remmen., Onder pathologische stress (IL-1β, TNF-α, hypoxie) wordt de TIMP-1 secretie verhoogd om verhoogde katabole activiteit tegen te gaan (Lozito and Tuan, 2011). Bovendien is de remming van MMP niet specifiek; TIMP-1 kan de meeste MMPS remmen (Visse en Nagase, 2003), makend MSCS een nog veelzijdiger hulpmiddel voor het herstellen van de metabolische balans van degenererend kraakbeen.

Chondrogenese

Matricellulaire eiwitten, uitgescheiden matrixeiwitten met regulerende rollen, binden aan ECM en fungeren als receptoren voor cel-oppervlaktemoleculen, groeifactoren en MMP ‘ s (Bornstein et al ., 2000)., Trombospondin (TSP2) bijvoorbeeld is een bekende regulator van kraakbeen-en botdifferentiatie en wordt uitgescheiden door MSC ‘ s om proliferatie via autocrine mechanismen te induceren (Hankenson and Bornstein, 2002). TSP2, uitgescheiden door humaan navelstrengbloed-afgeleid (UCB)-MSCs behandeld met synoviaal vocht van patiënten met OA, induceerde differentiatie van chondroprogenitor cellen. Het bevorderde kraakbeenregeneratie in een konijn full-thickness osteochondral-defect model (Jeong et al., 2013)., TSP2 bleek een autocrine werking te hebben op humane UCB – MSCs, BM-MSCs en ASCs, het bevorderen van kraakbeendifferentiatie en het voorkomen van hypertrofie (Jeong et al., 2015). Hoewel de gegevens beperkt zijn, zijn er aanwijzingen dat TSP2 een van de belangrijkste paracriene spelers is in MSC-gemedieerde kraakbeenregeneratie.

immunosuppressie

de rol van ontsteking bij de vestiging en het behoud van OA wordt nu algemeen aanvaard (Ayral et al., 2005) met synoviale membraanontsteking een kenmerk van oa pathologie (Goldring, 1999; Pelletier et al., 2001)., Histologische studies tonen aan dat OA-patiënten een variabele graad van synovitis hebben, met hogere niveaus van pro-inflammatoire cytokines en infiltratie van immuuncellen, voornamelijk macrofagen (Benito et al., 2005). Biologische markers van ontsteking positief correleren met kniepijn (Baker et al., 2010; Scanzello et al., 2011) en klinische progressie van de ziekte (Krasnokutsky et al., 2011; Roemer et al., 2011)., Gelicentieerde MSC ‘ s scheiden een reeks ontstekingsremmende cytokines af die kunnen helpen een evenwicht in het ontstoken synovium te herstellen: MSC-geconditioneerd medium (CM) verminderde productie van ontstekingsmediatoren in oa gezamenlijke explantaten (van Buul et al., 2012).

Di Nicola et al. eerst werd de kans op allogene MSc-afstoting beoordeeld in een gemengde lymfocytenreactie (MLR). In plaats van een immuunrespons op te roepen, onderdrukten de cellen proliferatie van T-cellen (Di Nicola et al., 2002; Krampera et al., 2003)., De relevantie van MSC-secreted factoren in immunomodulatie werd aangetoond door het vermogen van hun supernatans om immuuncellen af te leiden van gewonde organen (Parekkadan et al., 2007). Momenteel worden MSC ‘ s geëvalueerd in tal van klinische studies voor vele inflammatoire aandoeningen (Trounson and McDonald, 2015).

een van de belangrijkste effecten van MSC-gemedieerde immuunsuppressie is prostaglandine-E2 (PGE2). PGE2 wordt constitutief uitgescheiden door MSCs en de productie ervan wordt dramatisch verbeterd via stimulatie door interferon (IFN)-γ, TNF-α (English et al., 2007), of IL-1β (Chen et al., 2010)., PGE2 heeft een negatieve invloed op de proliferatie van T – (Martinet et al., 2009) en natural killer (NK) cellen (Sotiropoulou et al., 2006), veroorzaakt een verhoging van de pool van regelgevende t (Treg) cellen, bevordert macrofagen om IL-10 te produceren en verhindert monocytes zich in dendritische cellen (DCs) te onderscheiden (Aggarwal en Pittenger, 2005). In OA, bemiddelt PGE2 ASC therapeutische gevolgen en is een regelgevend controlepunt in immune-modulatie. Manfredini et al., bewijs geleverd dat de PGE2 / COX2-route verantwoordelijk is voor de inductie van IL-10 en de remming van TNFa en IL-6 om een M2-switch in menselijke synoviale macrofagen te induceren (Manferdini et al., 2017).

Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) katalyseert de afbraak van tryptofaan, wat onderdrukking van T-cellen veroorzaakt. Het wordt aangewend door DCs om immune reacties te moduleren (Mellor en Munn, 2004), maar kan door MSCs op IFN-γ stimulatie worden afgescheiden (Krampera et al., 2006). In een humane MLR was IFN-γ-geïnduceerde expressie van IDO in MSCs verantwoordelijk voor onderdrukking van t-celproliferatie (Meisel et al., 2004)., Het drijft ook M2 polarisatie in macrofagen en induceert een tolerogeen fenotype in DCs en Tregs (Ge et al., 2010; Sica en Mantovani, 2012). Het belang ervan in MSC-gemedieerde immunosuppressie is gevalideerd met behulp van specifieke remmers en knockout MSC ’s (Krampera et al., 2006; English et al., 2007; Spaggiari et al., 2008).

TNF-induceerbaar gen (TSG)-6 staat bekend om zijn veelvoudige en diverse ontstekingsremmende mechanismen (Wisniewski and Vilcek, 2004). Geproduceerd als reactie op inflammatoire signalen, heeft het een centrale rol in MSC-gemedieerde immunosuppressie (Lee et al., 2009)., Aan de andere kant werd het geïdentificeerd als een van de meest significant up-gereguleerde genen in menselijk oa articulair kraakbeen (Chou et al., 2015) en voorgesteld als een ziekte biomarker, als zijn activiteit in synoviale vloeistof voorspelde oa progressie (Wisniewski et al., 2014). TSG-6 heeft een complexe rol in kraakbeenpathologie, aangezien het betrokken is bij matrixassemblage tijdens de synthese van nieuw weefsel (Chou et al., 2018).

de rol van apoptotische MSC ‘s

na toediening kunnen MSC’ s biologische veranderingen ondergaan die radicaler zijn dan differentiatie of vergunningverlening. Toupet et al., waargenomen dat de meeste MSCs verdwijnen 10 dagen na de IA-injectie in een muriene model van OA, met vergelijkbare resultaten verkregen met syngeneic en xenogene menselijke ASCs (Toupet et al., 2013, 2015). Ondanks de dood en klaring van toegediende cellen worden significante therapeutische effecten waargenomen als reactie op IA-injectie van Muizenasc ‘ s (ter Huurne et al., 2012; Schelbergen et al., 2014).

apoptotische cellen communiceren met immuuncellen via twee verschillende mechanismen: directe effecten geassocieerd met apoptotische cellen zelf en indirecte effecten veroorzaakt in fagocytiserende cellen (Figuur 2)., Directe effecten omvatten secretie van IL-10 en TGF-β, het genereren van een immunosuppressieve micro-omgeving (Chen et al., 2001; Korns et al., 2011). Dit milieu remt lipopolysaccharide (LPS)-gestimuleerde macrofagen van de secretie van IL-1β en TNF-α (McDonald et al., 1999). Indirecte effecten worden geassocieerd met eliminatie van apoptotische cellen door fagocyten, resulterend in een verminderde respons op LPS (Perruche et al., 2009) en een overstap naar een ontstekingsremmend profiel (Fadok et al., 1998)., Immuuncellen die apoptotische cellen internaliseren, veroorzaken ook geen CD4 + T-helpercellen, waardoor de effectorlymfocyten in een “hulpeloze” toestand verkeren (Griffith et al., 2007) en veroorzaken klonale uitbreiding van Foxp3 + Treg cellen (Xia et al., 2007; Perruche et al., 2008).

met behulp van een muriene model van graft-vs.,-gastheerziekte (GVHD), toonden onderzoekers aan dat geïnfundeerde MSc apoptose wordt geïnduceerd door de ontvangende T-cellen via cel – naar-celcontact met afgifte van perforine-en granzyme B-bevattende granules (Galleu et al., 2017). Fagocytes werden ook getoond om een belangrijke rol te hebben producerend IDO op het overspoelen apoptotic MSCS. Toen deze componenten werden neergehaald of geremd, werd de therapeutische doeltreffendheid van MSCs verloren. Belangrijker nog, infusie van MSCs gaf apoptotische ex vivo herstelde therapeutische effecten. Interessant is dat de respons van de patiënt op MSCs correleerde met hun cytotoxische capaciteit., Deze bevindingen leveren bewijs dat apoptose een van de drijvende krachten is van MSC-gemedieerde immunosuppressie.

TGF-β-gemedieerde tolerantie-inductie is het meest gerapporteerde mechanisme in preklinische studies van extracorporale fotoferese, de toediening van ex vivo apoptotische leukocyten. Een sterk immunomodulerend effect werd waargenomen bij inflammatoire artritis (Michlewska et al., 2009; Perruche et al., 2009) en fotoferese is een goedgekeurde therapie voor cutaan T-cellymfoom en GvHD (Weitz et al., 2015)., Apoptose kan ook een belangrijke component van MSC therapie in OA vertegenwoordigen. Ongepubliceerde gegevens in ons laboratorium tonen Zo laag als 1.6% MSc engraftment 3 dagen na IA-toediening van GFP+ MSCs in muizen oa knieën. Fluorescerende cellen werden niet gedetecteerd in een aangrenzend weefsel, met inbegrip van lokale lymfeklieren. Dit versterkt de hypothese dat de geïmplanteerde cellen apoptosis konden ondergaan en ontsteking met latere bescherming tegen oa ontwikkeling konden moduleren. Terwijl apoptose na infusie een voorbijgaande gebeurtenis is, Galleu et al., toonde aan dat de daaropvolgende reactie een herprogrammering van bepaalde aspecten van het gastheerimmuunsysteem zou kunnen vertegenwoordigen (Galleu et al., 2017).

verder kijkend: extracellulaire blaasjes

De paracrinewerking van MSCs is niet beperkt tot oplosbare factoren. MSCs, zoals vele andere cellen, zijn getoond om extracellulaire blaasjes (ECVs) te produceren (Lai et al., 2010), kleine structuren die in een phospholipid bilayer worden ingesloten, die vele cytoplasmic componenten dragen., ECVs zijn betrokken bij intercellulaire communicatie door horizontale overdracht van mRNA en eiwit en zijn gegroepeerd op basis van grootte, met verschillende samenstelling en biogenese. Exosomes variëren tussen 40 en 100 nm in diameter. Zij worden constitutief vrijgegeven van het late endosomal compartiment door fusie van multivesicular lichamen met het plasmamembraan, maar hun productie kan op cytoskeletonactivering toenemen. Exosomes worden gekenmerkt door proteã nen die voor hun vorming en vervoer, zoals tetraspanins, Alix en het gen 101 van de tumorgevoeligheid worden vereist., Microvesicles zijn een heterogene populatie van ECVs tussen 100 en 1000 nm die via directe ontluikende op activering door een spanningssignaal wordt gegenereerd, dat de fosfolipidebalans van het membraan verandert, die lipidevlotten vormen. Microvesicles worden gekenmerkt door membraantellers specifiek voor het ouder celtype. In preklinische modellen werd waargenomen dat ECV ‘ s anti-apoptotisch (Bruno et al., 2012), anti-fibrotisch (Li et al., 2013), pro-angiogeen (Bian et al., 2014), en ontstekingsremmende effecten (Lee et al., 2012)., MSc-afgeleide ECVs induceren generatie van Tregs, remmen proliferatie van lymfocyten (Mokarizadeh et al., 2012), macrophages (Zhang et al., 2014), en B-cellen (Budoni et al., 2013). ECVs alleen kan echter niet dezelfde immunomodulerende effecten van oudercellen leveren, waarbij cel-celcontact nog steeds nodig is om de lymfocytenproliferatie en-functie te moduleren (Conforti et al., 2014).

MSC-afgeleide ECV ‘ s leverden veelbelovende resultaten op in rattenmodellen voor osteoporose (Qi et al., 2016) en herstel van osteochondrale defecten (Zhang et al., 2016). Meer recent werden MSC-ECVs getest in OA-modellen., Exosomen afgeleid van synovium MSCs en geïnduceerde pluripotente stamcellen verzwakte ziektescores in een collagenase-geïnduceerd oa (CIOA) muismodel, door chondrocytenproliferatie en migratie te bevorderen (Zhu et al., 2017). Met name, exosomen afgeleid van synoviale MSCs overexpressie miR-140-5p veroorzaakte proliferatie van chondrocyten in vitro. Bij toediening in een ratmodel van progressie van de ziekte van OA en kraakbeendegeneratie werden significant vertraagd (Tao et al., 2017). Cosenza et al. geleverd MSC-ECVs in een CIOA model en gemeld verminderde gewrichtsschade (Cosenza et al., 2017)., Het gebruik van MSC-ECVs als therapie voor OA zou vele voordelen in vergelijking met cel-afgeleide producten brengen, vermijdend bezorgdheid van mogelijke kwaadaardige transformaties. Er kunnen zich echter problemen voordoen met de ECV-productie, omdat deze specifiek moeten worden afgestemd op de te behandelen indicatie. Bovendien is hun productie nog niet gestandaardiseerd voor klinische productie, zoals het geval is voor cellulaire producten.

conclusies

rapporten die hier zijn samengevat suggereren een significant potentieel voor het gebruik van MSCs of MSC-CM bij OA., In vitro resulteerde co-culture van OA chondrocyten met ASC-CM in NF-kB-gemedieerde cytoprotectieve effecten via verhoogde productie van collageen II, remming van IL-6, TNF en verschillende MMP ‘ s, evenals upregulatie van IL-10 (Platas et al., 2013). Evenzo, met behulp van oa kraakbeenexplantaten, MSc-CM werd getoond om te interfereren met de NF-kB-route om anti-inflammatoire en anti-katabole effecten te bemiddelen (van Buul et al., 2012). MSC ‘ s zijn al een waardevol instrument gebleken voor vele aandoeningen, waaronder acute GvHD (Le Blanc et al., 2008) en multiple sclerose (Karussis et al., 2008).,

Fase I klinische studies hebben de veiligheid aangetoond van directe IA toediening van MSCs bij patiënten met OA (Centeno et al., 2008; Davatchi et al., 2011). In 2012 werd pijnreductie gemeld tot 6 maanden na injectie van 20-24 miljoen MSCs, met verhoogde kraakbeendikte en vermindering van oedemateuze subchondrale pleisters bij drie van de zes patiënten (Emadedin et al., 2012). Jo et al., injecteerde hogere doses ASCs( tot 10 × 108), waarbij een significant verbeterde Womac score werd verkregen met een klinisch betekenisvolle pijnvermindering en, belangrijker nog, geregenereerd hyalien gewrichtskraakbeen in de ernstigste gedegenereerde plaats in de knie (Jo et al., 2014). In de adipoa-studie verbeterde een enkele dosis van 2 miljoen ASCs significant de pijnniveaus en functie (Pers et al., 2016).

samengevat kunnen MSC ‘ s werken door een hit-and-run mechanisme in plaats van stabiel te graveren in het weefsel., Autopsies van patiënten die MSC IV infusies kregen voor verschillende aandoeningen binnen een jaar voor de dood bevestigen dat donor MSCs normaal gesproken niet in het gastheerweefsel worden vastgehouden. Detectie van donor-DNA correleerde niet met de mate van HLA-mismatch of de klinische respons, wat erop wijst dat de klaring niet immuungemedieerd is (von Bahr et al., 2012). Echter, de rol van celdood in het bemiddelen van de therapeutische effecten van MSCs vereist verder onderzoek en het fenotype en de activiteit van cellen die zelfs voor een korte tijd op de plaats van implantatie overleven opgehelderd.,

Auteur Bijdragen

PM: bijgedragen aan de ontwikkeling van het concept ten grondslag liggen aan de evaluatie, onderzoek gedaan naar de relevante literatuur, en schreef het lichaam van de review; SR: ook bijgedragen aan het concept van het manuscript en hielp bij het schrijven; AG: onderzocht de literatuur over apoptose; JMM: deelgenomen aan manuscript in voorbereiding, op-gaan en een definitieve beoordeling van de aanvraag; FB: ook deelgenomen aan manuscript conceptie en te beoordelen.

financiering

PM wordt gefinancierd door Science Foundation Ireland via Cúram (subsidie nr., 13/RC / 2073) en de Irish Blood Transfusion Service. SR wordt gefinancierd door een NUI Galway Hardiman beurs. JMM en FB door de Europese Unie (H2020 PHC16-2015, subsidie nr. 667932; H2020-PHC-2014-2015, subsidie nr. 643809) en door Science Foundation Ireland via Cúram (subsidie nr. 13/RC/2073).

belangenconflict verklaring

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relatie die als een potentieel belangenconflict kon worden opgevat.

Dankbetuigingen

we willen Maciek Doczyk bedanken voor het ontwerpen van de cijfers.,