Frontiers in Microbiology

oude geschiedenis

De wetenschap van de microbiële fysiologie begon waarschijnlijk toen Leeuwenhoek voor het eerst gefascineerd raakte door de aanblik van Vorticella die de trilharen verslaat. Ik stel voor dat zoals de meeste waarnemingen van microben, van de eenvoudigste tot de meest geavanceerde, deze een fysiologische component heeft., Met de komst van de moderne microbiologie in het midden van de 19e eeuw, werd dit nieuwe onderzoeksgebied opvallend en herkenbaar met ontdekkingen van processen zoals anaerobiose en sporulatie, samen met de erkenning van fermentatie als een microbiologisch fenomeen. Kort daarna kwamen de studies van Winogradsky en zijn volgelingen over de chemische veranderingen in het milieu die het gevolg zijn van microbiële activiteiten. Later nog, tijdens de eerste helft van de 20e eeuw, microbiële fysiologie was een belangrijke bijdrage aan de biochemie en speelde een sleutelrol in de opheldering van centrale metabolisme.,

het begrip van de fysiologie van bacteriegroei bleef echter achter. Zelfs in het begin van de jaren vijftig was een student microbiologie, zoals ik, die wilde begrijpen wat er gebeurt als bacteriën groeien, moeilijk te vinden om nuttige gidsen te vinden. In de studieboeken van die tijd lag de focus op de groeicurve, met zijn deprimerend onverstaanbare opeenvolging van fasen en de implicatie dat ze stadia van een verplichte levenscyclus representeerden. Maar zelfs vanaf de vroegste dagen van de microbiologie, waren er bakens van helder denken over het onderwerp., Een van Pasteur ‘ s eerste studenten, Raulin (1869), voerde kwantitatieve groei-experimenten uit met de schimmel Aspergillus niger die verrassend genoeg zijn vermogen onthulde om te groeien op een eenvoudige suiker en een paar minerale zouten. Raulin ‘ s minimale medium is niet erg verschillend van die gebruikt vandaag. Pasteur zelf geloofde bijna obsessief dat de morfologie en activiteiten van microben worden bepaald door hun omgeving.

na verloop van tijd verzamelde zich een uitgebreide literatuur over groeiexperimenten, sommige fantasierijk, andere exact van opzet en nauwgezet in uitvoering., Opmerkelijk voor zijn helderheid van denken is Henrici ‘ s klassieke Henrici, (1928) rapport over hoe bacteriën veranderen in grootte tijdens hun groeicyclus. Ondanks zulke voorbeelden van scherpzinnig inzicht bleef een mist de groeifysiologie omhullen, gevoed door eigenzinnige noties. Bijvoorbeeld, dachten sommigen dat de opbrengst van bacteriële culturen werd beperkt door een entiteit genaamd ” biologische ruimte.”Anderen zagen de groeicurve als onverbiddelijk S-vormig, aldus bepaald door de logistische vergelijking die voor het eerst werd gepubliceerd door Pierre Verhulst (1845). (Ik ben mensen tegengekomen die dit tot op de dag van vandaag geloven.,) Gedurende deze periode, de heiligheid van de groeicurve heerste. In een recensie over groei uit 1949 verklaarde zelfs van Niel (1949): “bijna alles wat bekend is over de kinetiek van de groei van micro-organismen is geleerd uit studies van zogenaamde groeicurven.”

recente geschiedenis

De mist begon op te tillen met het werk van, onder andere, twee mensen die later vader van de moleculaire biologie werden, Alfred Hershey in de late jaren 1930 en Jacques Monod in de jaren 1940 (figuren 1, 2)., Hershey (Hershey, 1939) (in samenwerking met zijn voorzitter, Jacques Bronfenbrenner) overwoog het gebruik van een cultuur in de logfase van de groei als entmateriaal om een nieuwe cultuur te starten, waardoor de onschendbare heiligheid van de groeicurve werd verdreven. Monod (1942) stuurde de groeirespons van hele culturen naar enzymkinetiek en toonde aan dat de groeisnelheid op Michaelis–Menten wijze afhankelijk was van de substraatconcentratie, terwijl de opbrengst evenredig was met de beschikbare hoeveelheid substraat., Deze experimenten werden uitgevoerd met culturen die in een stabiele toestand groeiden, een belangrijk punt waarop ik binnenkort zal terugkomen. Monod, waarschijnlijk ontevreden over de heersende opvatting dat het veld oppervlakkig is, zocht al snel elders in zijn zoektocht naar moleculaire mechanismen. Het is opmerkelijk dat zijn studies over de regulatie van genexpressie voortkwamen uit zijn groei fysiologisch werk over “diauxische groei”, een fenomeen waarbij het hebben van glucose in het medium de groei op andere suikers belemmert., Hij liet een allesomvattend maar afwijzend afscheidingsschot achter (Monod, 1949): “de studie van de groei van bacterieculturen vormt geen gespecialiseerd onderwerp of tak van onderzoek: het is de basismethode van de microbiologie.”Als discipline, fysiologie van bacteriegroei kwam dicht bij het overgaan van verwarring naar vergetelheid in een enkele sprong.

zoals soms het geval is, werd het latere werk vergemakkelijkt door een duidelijke definitie. In Campbell (1957) stelde voor dat de stabiele toestand groei voorwaarde worden aangeduid als “evenwichtige groei.”Daarmee verhief hij wat voorheen slechts één fase in de groeicurve was (de log-fase) tot een algemeen concept. In zekere zin, het verplaatsen van de observatie van log fase naar het concept van evenwichtige groei is als het gaan van het kijken naar appels vallen om te denken aan de zwaartekracht., Cellen in evenwichtige groei bereiken de maximale groeisnelheid mogelijk voor dat specifieke medium. Men kan fantaseren dat de meest gekoesterde ambitie van een bacterie is om zo snel mogelijk te groeien, waardoor minder productieve concurrenten overtreffen. Maar evenwichtige groei heeft een ander belangrijk en uniek kenmerk: het is de enige gemakkelijk reproduceerbare groeiconditie. Bedenk hoe veranderlijk in de tijd alle andere staten in de groei van een cultuur zijn. Monster nu en monster een paar minuten later, en je vindt dat de cellen al verschillende eigenschappen hebben., Helaas wordt dit eenvoudige punt ook nu nog niet altijd in aanmerking genomen bij het vaststellen van onderzoeksprotocollen. Zie a reasoned excoriation aimed at the practitioners of sloppy culturing door Neidhardt (2006). Een onnoemelijke hoeveelheid werk uitgevoerd met culturen in ongedefinieerde stadia van groei is niet reproduceerbaar, dus het is verspild.

Het belang van groei in een steady state was al eerder gerealiseerd, maar Campbell ‘ s nieuwe en precieze term hielp de aura van onveranderlijkheid uit de groeicurve te verwijderen., Het gaf de vrijheid om culturen te manipuleren door ze bijvoorbeeld herhaaldelijk te verdunnen om ze in een evenwichtige groei te houden. Een van de interessantste van deze manipulaties in de vroege jaren 1950 was de ontwikkeling van continue culturen in chemostaten (Monod, 1949; Novick en Szilard, 1950).in het midden van de jaren vijftig werd de groeifysiologie uitgebreid tot een van de belangrijkste aandachtspunten van die tijd: de relatie tussen nucleïnezuren en eiwitsynthese. Hier verandert dit verhaal in een nogal selectief, persoonlijk verslag. In 1956 werd ik lid van het lab van Ole Maaløe in Kopenhagen (Figuur 3)., Uiteindelijk zou veel werk op het gebied van groeifysiologie uit zijn lab komen en de mensen die daar waren geweest werden collectief bekend als de “Kopenhagen School” (Maaløe en Kjeldgaard, 1966; Cooper, 2008). De vroegste bevinding, waarop het latere werk baseerde, was dat cellen van één soort in verschillende snelheden (in evenwichtige groei, natuurlijk!) verschilden in grootte afhankelijk van de groeisnelheid, met de snellere die groter worden. Bijgevolg hebben cellen die in twee verschillende media groeien maar bij hetzelfde groeisnelheid dezelfde celgrootte., Het Copenhagen lab was niet alleen in dergelijke studies (Schaechter et al., 1958). Uitgebreide experimenten met betrekking tot RNA-gehalte aan groeisnelheid werden ook gemeld door Neidhardt en Magasanik (1960), Neidhardt (1963) en Herbert (1961). Zo werd een aanzienlijk venster geopend voor moleculaire mechanismen en Monod werd tot op zekere hoogte verkeerd bewezen.

Ik moet vermelden dat dit werk zoveel mogelijk mogelijk werd gemaakt door de strengheid die Maaløe aan experimentele metingen bracht., In zijn lab werden levensvatbare tellingen zo precies uitgevoerd dat de experimentele fout consequent kleiner was dan een willekeurige bemonsteringsfout (en dat was vóór nauwkeurige pipetteergadgets). Of, om de groeisnelheid van een cultuur te bepalen, werden metingen van de optische dichtheid (massa) ten minste 10 keer uitgevoerd in de loop van elke verdubbeling van de cultuur. Maar het diepere punt was het streven naar een kwantitatieve benadering van het bestuderen van groei.

waarom zouden bacteriële cellen van dezelfde soort verschillen in grootte?, Bacteriën van drooggewicht bestaan voornamelijk uit eiwitten, dus kunnen snelgroeiende cellen groter zijn omdat ze meer proteïne-synthetiserende ribosomen bevatten? Toen we het gehalte aan ribosomen in cellen die met verschillende snelheden groeien, gemeten, vonden we, tot onze vreugde, dat er ook hier een eenvoudige relatie was: hoe sneller de groeisnelheid, hoe meer ribosomen per celmassa (Ecker en Schaechter, 1963). Met andere woorden, de concentratie van ribosomen bleek een lineaire functie van de groeisnelheid. Alsof om de regel te testen, deze relatie breekt in zeer trage tempo., Dit is zinvol omdat anders cellen die oneindig langzaam groeien geen ribosomen zouden hebben en geen proteã nen zouden kunnen maken wanneer geplaatst in een rijker medium. Uiteindelijk werd de concentratie van vele andere cellulaire componenten als functie van de groeisnelheid in enig detail bekend (Bremer en Dennis, 1996). Vanwege zo ‘ n afhankelijkheid gehoorzamen bacteriën aan de stelregel van de Spaanse filosoof José Ortega y Gasset dat ik graag citeer: “ik ben ik en mijn omstandigheid” (Yo soy yo y mi circunstancia).

deze studies hebben betrekking op bacteriële populaties. Wat dacht je van losse cellen?, Hun levensduur wordt beschreven door hun celcyclus en is verschillend van de groeicurve. Het hangt in plaats daarvan af van wat er gebeurt tussen de ene divisie en de volgende. Welke gebeurtenissen gebeuren tijdens de celcyclus? Het werd waargenomen vroeg op gebruikend vrij eenvoudige microscopie en bevestigde recenter door meer verfijnde hulpmiddelen dat de toename van massa in het kweken van bacteriën exponentieel is. Met andere woorden, de groei is toe te schrijven aan een autocatalytic uitbreiding van de meeste celcomponenten., De bestanddelen zoals ribosomen en de proteã nen zijn gewoonlijk aanwezig in een groot aantal exemplaren; daarom hoeven zij niet allen hun synthese in één keer in werking te stellen. Een ribosoom kan nu gemaakt worden, een ander een ogenblik later, en toch zal hun populatie, in het totaal exponentieel uitbreiden. Maar de situatie verschilt voor elementen die aanwezig zijn in een of een klein aantal kopieën, te weten, het chromosoom en de cel zelf. Zijnd unitaire gebeurtenissen, moeten beide processen heel precies worden geregeld, opdat de bevolking van cellen errantly heterogeen wordt., Maar in de jaren 1950 en vroege jaren 1960, waren er weinig hulpmiddelen om de timing van DNA-replicatie in enkele cellen te bestuderen. Deling synchronisatie van een cultuur kon niet gemakkelijk worden bereikt zonder de normale groei te verstoren, bijvoorbeeld door de cultuur te onderwerpen aan temperatuurverschuivingen.

het vroegste model voor de regulering van de chromosoomcyclus werd voorgesteld door Helmstetter et al. (1968), Cooper and Helmstetter (1968) gebaseerd op een uitdrukkelijk niet-opdringerige methode om bacteriële cellen te synchroniseren. Ze maakten gebruik van de” baby machine”, een apparaat om onopvallend” pasgeboren ” cellen te verzamelen., Men wist dat het chromosoom van Escherichia coli uit één enkel molecuul van DNA is samengesteld en dat zijn replicatie bij één plaats begint, de oorsprong, en bij een andere eindigt, het eindpunt. Het H&C-model stelde voor dat het interval tussen initiatie en beëindiging bij een bepaalde temperatuur vrijwel constant is, ongeacht de groeisnelheid en de rijkdom van het medium. Verordening heeft derhalve voornamelijk betrekking op de inleiding van de procedure, en dit werd het middelpunt van dergelijke studies. Maar in snel groeiende cellen kan de tijd die nodig is voor chromosoomreplicatie langer zijn dan de celcyclus., Dit leidde tot het voorstel dat initiatie niet hoeft te wachten op beëindiging, maar kan plaatsvinden voordat de vorige replicatie eindigt, waardoor meerdere gelijktijdige replicatie gebeurtenissen op een chromosoom—de zogenaamde “multifork replicatie” (Yoshikawa and Sueoka, 1963).

deze denkwijzen leidden tot latere onderzoeken naar de mechanismen die bacteriële genexpressie en chromosoomreplicatie controleren. Hoe wordt de synthese van ribosomal RNAs en proteã nen geregeld? Wat heeft dit te maken met de controle van genexpressie? Hoe wordt chromosoomreplicatie geregeld?, En zo verder. Ik heb aan dit werk deelgenomen en heb veel plezier van het verfijnde begrip van de mechanismen die zijn ontrafeld. Echter, Ik sta nog steeds onder de indruk van het centrale wonder—het vermogen van dergelijke schijnbaar eenvoudige cellen om te groeien in zo ‘ n perfect ritme. Voor een helder manifest van deze visie, zie het commentaar van Neidhardt (1999).

Studies naar de mechanismen die de groei reguleren werden sterk ondersteund door genetische analyse. Een groot aantal voorwaardelijke mutanten, vooral van E. coli, werden geconstrueerd, bijvoorbeeld, sommige hittegevoelige (zie Hirota et al.,, 1968), some cold sensitive (zie Ingraham, 1969). Het bestuderen van hun fenotype bij de beperkende temperaturen onthulde veel over de biochemische basis voor groei en werd een essentiële aanvulling op de zuiver fysiologische experimenten.hoewel de school van Kopenhagen de nadruk legde op een kwantitatieve benadering, was het mechanistische begrip van groeifenomenen in ieder geval in een vroeg stadium onmiskenbaar beperkt. Francis Crick kwam daar zo snel achter. Toen ik hem in 1958 in het Cavendish Laboratorium van de Universiteit van Cambridge bezocht, flapte hij uit: “Gefeliciteerd!, Jullie begonnen een nieuw veld, maar het is voorbij!”Slik! In enge zin was dit voor die tijd waar, hoewel ik zelfs toen al schuchter had kunnen beweren dat de fysiologische focus op de groeiende cel een noodzakelijk contrapunt had bijgedragen aan moleculair reductionisme. Maar het kostte tijd. Ongeveer 50 jaar lang, tot rond het begin van de 20e eeuw, bleef de groeifysiologie min of meer in een latente staat.

onlangs heeft de microbiële groeifysiologie een wedergeboorte gezien in een vorm die streeft naar een dieper kwantitatief begrip van fenomenen op een heel celniveau., Dit wordt geïllustreerd door de opkomst van systeembiologie: een benadering die mogelijk wordt gemaakt door technologieën die kolossale hoeveelheden informatie kunnen verzamelen en analyseren om te onthullen hoe intracellulaire transacties met elkaar verbonden zijn. Ik heb zelfs horen zeggen dat systeembiologie slechts een allesomvattende kijk is op celfysiologie, of, als je wilt, een voortzetting van de ontsnapping uit biochemisch reductionisme. Zoals waar door de geschiedenis heen is geweest, wordt het onderzoek naar microbiële fysiologie nog steeds geleid door de ontwikkeling van nieuwe methoden van experimentele en wiskundige analyse., Een paar voorbeelden (van vele) kunnen worden gezien in de spannende papers door Edwards et al. (2001), Wang et al. (2010), Valgepea et al. (2013), Klumpp and Hwa (2014), en Scott et al. (2014).

Hoe is de bacteriegroeifysiologie van vroeger verbonden met de systeembiologie van vandaag? Zowel historische als conceptuele draden zijn duidelijk zichtbaar (Schaechter, 2006). Oude vragen, zoals hoeveel macromoleculaire componenten in een cel zijn, hoe snel ze worden gemaakt, en hoe hun interacties resulteren in celgroei, kunnen nu worden bestudeerd met moderne hulpmiddelen., Toch hebben de nieuwere methoden nog steeds een directe verbinding met de oudere. Een voorbeeld is de proteomic meting van het kweken versus gestresste E. coli, eerst gedaan op grote schaal in het laboratorium van Neidhardt (2011). De eerste aanzet voor dit werk was het bepalen van het aantal eiwitten gemaakt bij verschillende groeisnelheden van de cultuur, die al snel werd gericht op het bestuderen van de effecten van fysiologische stress., Maar deze benadering werd snel vervangen toen deze onderzoekers zich realiseerden dat dergelijke studies grotendeels waren gericht op wat de onderzoeker interessant, nuttig, of potentieel vitaal voor de cel dacht. Al snel zagen ze dat de nieuwe methoden voor het onderzoeken van de wereldwijde productie van eiwitten, met name tweedimensionale gelelektroforese, de onderzoeker in staat stelden om de bal in het veld van de microbe te zetten en te ontdekken wat de cel belangrijk vond., Vele dergelijke studies van de proteã nen gemaakt bij verschillende de groeipercentages en temperaturen, evenals wanneer onder diverse spanningen, leidden tot een genuanceerde appreciatie van de cel als dynamisch systeem, met een uitgebreid universum van regels en verhoudingen die zijn fysiologie en metabolisme regeren.

een belangrijke waarde van systeembiologie ligt in zijn vermogen om voorspellende modellen te creëren, iets wat in aanzienlijke mate is bereikt met gist en wordt gerealiseerd met bacteriën. We beginnen een multidimensionaal beeld te krijgen van het complexe netwerk van interacties dat leidt tot de groei van een cel., Zoals altijd moet de experimentele basis voor dit werk bestaan uit het kweken van de cellen onder reproduceerbare en gemakkelijk assayable omstandigheden, met andere woorden, het gebruik van culturen in evenwichtige groei als basisvoorwaarde. Dit is slechts één van de concepten die systeembiologie erft van de groeifysiologie.

Enfin, liefhebbers van evenwichtige groei, zoals ikzelf, worden er vaak aan herinnerd dat deze toestand ongebruikelijk van aard is. Dit is niet de schuld van de cellen., De meeste planktonische cellen en mogelijk veel sessiele cellen groeien zo snel als de omstandigheden het toelaten (hoewel de overvloedige cyanobacteriën in de oceaan reageren op niet-voedzame inducements, zoals hun diel klok). De microbiële milieu ‘ s zijn hoogst veranderlijk en staan gewoonlijk slechts korte spurts van ongehinderde groei toe die de infusie van levensmiddel volgen. Een evenwichtige groei over langere perioden wordt vooral in het laboratorium gevonden. Maar de experimentator die voorwaarden biedt die een evenwichtige groei mogelijk maken, doet niet meer dan cellen hun fundamentele verlangen om te groeien in actie te laten brengen., De cellen zorgen voor de rest.

belangenconflict verklaring

de auteur verklaart dat het onderzoek werd uitgevoerd zonder commerciële of financiële relaties die als een potentieel belangenconflict kunnen worden opgevat.met dank aan Doug Berg, John Ingraham, Fred Neidhardt, Irwin Rubenstein en Christoph Weigel bij het schrijven van dit artikel.