Mønstre av celle syklus checkpoint dereguleringen forbundet med egenverdi molekylær undergrupper av menneskelig brystkreft celler

De decatenation G2 sjekkpunkt er svekket i LumB bryst kreft cellelinjer

for Å vurdere G2/M checkpoint-funksjon, en MER analysen benytter to topo II-hemmere som viser forskjellige virkningsmekanismer var ansatt for å overvåke G2-M overgangen pris., Cellene ble inkubert med colcemid (for å hindre mitotic exit (avslutt) for 2-6 h i nærvær eller fravær av topo II katalytisk inhibitor ICRF-193 (som ikke åpenlyst skade DNA) til å måle decatenation G2 checkpoint funksjon eller topo II gift etoposide (som induserer DNA-skade) for å måle DNA-skade G2 checkpoint funksjon ved konsentrasjoner som ble arrestert 98-100% av normal menneskelig diploid fibroblaster (NHF1-hTERTs) og udødeliggjort lymphoblasts i G2.,36 bruk av colcemid i MER analyse blokker celler fra spennende mitose, slik at for en streng undersøkelse av G2 M overgang, og dermed minimere eventuelle confounding virkninger knyttet til pris av mitotic avslutt. MER ble beregnet ut fra den lineære delen av den resulterende linje (2-6 h tid poeng) og er uttrykt som prosentandel av celler inn mitose per time.36

MER eksempler er vist for HMEC cellelinje-R-HMEC-E i panelet til venstre i Fig 2a., Disse cellene akkumulert i mitose når inkubert i colcemid (og kjøretøy kontroll dimethyl sulfoxide (DMSO), lukkede plasser), som viser overgangen fra G2 til M, men i nærvær av katalysator inhibitor ICRF-193 (åpne sirkler), mitotic opphopning av R-HMEC-E-celler ble sterkt hemmet noe som tyder på at de fleste av disse cellene du vil aktivere en decatenation G2 checkpoint respons., I nærvær av topo II gift etoposide, den mitotic opphopning av R-HMEC-E-celler ble også sterkt hemmet (stengt trekanter), noe som indikerer at denne cellen linje viser en effektiv DNA-skade G2 sjekkpunkt. Derimot er LumB brystkreft cellelinje MDA-MB-453 fortsetter å akkumulere i mitose i nærvær av ICRF-193, men ikke etoposide (Fig. 2a, høyre panel), noe som tyder på at et flertall av disse cellene unndratt decatenation G2 checkpoint men arrestert i G2 på DNA-skade.

Alle 24 cellelinjer ble utsatt til MER-basert G2 checkpoint analysen og gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter for hver cellelinje (gruppert i henhold til molekylær subtype) er vist i Fig. 2b (enkelt celle linje gjennomsnitt ± SEM er gitt i Tabell S1)., Som forventet, er alle fire positiv kontroll HMEC celle linjer som vises alvorlige MER hemming i respons til ICRF-193 noe som tyder på at denne klassen viser en effektiv decatenation G2 sjekkpunkt. I kontrast, checkpoint funksjoner av bryst kreft cellelinjer var svært variabel (Fig. 2b). Ved gruppering av cellen linjer av iboende molekylær subtype, den LumB og BL celle linjer viste seg å ha svekket decatenation G2 checkpoint funksjon, mens HER2E og CL undertyper vises checkpoint funksjonen ligner på HMECs., Et sett av statistiske lineære blandede modeller (LMMs) ble ansatt for å sammenligne G2 checkpoint funksjoner mellom de forskjellige undertyper (se Utfyllende Informasjon, (SI)). Disse analysene etablert at LumB klasse (men ikke BL klasse) av bryst kreft cellelinjer som er utstilt feil i decatenation G2 checkpoint funksjon (**p < 0.05, FDR < 0.05)., Selv om fordelingen av % hemming av MER i BL celle linjer først dukket opp lik som den LumB gruppe, nærmere inspeksjon av MER data viste at BL gruppen viste svært lave MERs i fravær av en topo II katalytisk inhibitor, som indikerer at denne gruppen ble ikke svare på colcemid behandling, og dermed prosent hemming av MER vises kunstig lav i BL gruppen.,

Utfyllende eksperimenter ble utført for å vurdere om brystkreft celle linjer var i stand til å aktivere DNA-skade G2 sjekkpunkt med en konsentrasjon av topo II gift etoposide tilsvarende som for den katalytiske inhibitor ICRF-193 (4 µM). Alle fire HMEC celle linjer vises en effektiv DNA-skade G2 sjekkpunkt i respons til etoposide (Fig. 2c)., De fleste av bryst kreft cellelinjer også viste stort MER hemming i nærvær av etoposide og ingen signifikante forskjeller ble observert for noen av brystkreft cellelinje klasser; dermed er disse bryst kreft cellelinjer var i stand til å aktivere DNA-skade G2 checkpoint på nivåer som er sammenlignbare med de av HMECs, med unntak av DU4475 LumB cellelinje (Tabell S1).,

for Å bekrefte at ICRF-193 var i stand til å hemme topo II aktivitet i LumB celle linjer, cytogenetic forberedelser ble undersøkt i nærvær eller fravær av ICRF-193 og representant metaphases av to LumB celle linjer er vist i Fig. 2d. I nærvær av DMSO, de fleste av LumB metaphases utstilt individualisert kondensert kromosomer. Imidlertid, ved hemming av topo II med ICRF-193, >88% av alle LumB mitotic celler vises kromosomer som var under kondensert og/eller blandet (data ikke vist)., Dermed er det observert feil i decatenation G2 checkpoint funksjon var usannsynlig å være resultatet av en svikt i ICRF-193 å hemme topo II katalytisk aktivitet i LumB klasse, støtter konklusjonen om at mangelen skyldes dysfunksjonelle checkpoint aktivering og ikke en manglende evne til LumB klasse til å svare på ICRF-193 behandling.

Tidligere studier viser at p53 er aktivert i respons til ICRF-193, og cellelinjer med defekt decatenation G2 checkpoint funksjon utstilling svekket aktivering av p53.,36, 37 Derfor LumB og HMEC klasser ble undersøkt for å finne ut om cellelinjer mangler en decatenation G2 checkpoint utstilling svekket p53 phosphorylation. For å forenkle sammenligninger på tvers av ulike blotter og konto for eksponering forskjeller, den samme NHF1-hTERT prøven var lagt på hver gel og tilvekst av aktivering av p-Ser15 p53 for hver cellelinje ble normalisert til at av NHF1-hTERT intern kontroll. Som vist i den øvre panel av Fig. 2e, alle fire HMEC celle linjer svarte til ICRF-193 med induksjon av totalt p53 og p-Ser15 p53., Større økning i p-Ser15-p53 ble observert ved etoposide behandling i de fleste HMEC celle linjer, som betyr at aktivering av p53 signalering av ICRF-193 i HMECs er omtrent som observert i andre ikke-tumorigenic celle linjer.36 I kontrast til LumB celle linjer utstilt svekket induksjon p-Ser15 p53 i respons til ICRF-193 (Fig. 2e, nedre panel). Minst to av disse cellelinjer (HCC1428 og MDA-MB-453) viste seg å uttrykke lav eller undetectable nivåer av p53 til tross for mye villtype TP53 gener.,38 Bare MDA-MB-415 cellelinje utstilt en mutant form (Y236C) og høy basale nivåer av p53, noe som tyder på at aktivering av p53 ble oppveid av en mekanisme for andre enn mutasjon i de fleste av LumB linjer. Økningen av p-Ser15 p53 ved etoposide behandling for LumB klasse var ikke statistisk forskjellig fra HMEC klasse (Fig. S1B), noe som tyder på at svekket signaliserer var ikke på grunn av tap av en iboende evne til å phosphorylate Ser15 av p53, men ble heller mindre mottakelig for topo II katalytisk hemming.,

Aktivering av p-Ser 1981 av ATM og p-Thr 68 av Chk2 kan bidra til p-Ser15 aktivering av p53 og har også blitt observert på ICRF-193 eksponering;36 imidlertid ingen signifikante forskjeller i MINIBANK eller Chk2 aktivering ble observert i LumB klasse sammenlignet med de HMEC klasse, sannsynligvis på grunn av høye nivåer av variasjon blant cellelinjer (Fig. S1A–B). Western blot av alle cellelinjer som består av de resterende iboende undertyper er vist i Fig. S1C-G., Ingen av de iboende undertyper viste en statistisk signifikant nedgang i MINIBANK eller Chk2 i forhold til HMEC klasse ved enten ICRF-193 eller etoposide eksponering (Fig. S1B); men Her2E klasse også utstilt svekket aktivering av p53 i respons til ICRF-193. På grunn av den korte eksponeringstiden (3 t), dette kan være en følge av lavere vekst av Her2E linjer som beskrevet nedenfor. Til sammen utgjør disse resultatene indikerer at LumB klasse havner en defekt decatenation G2 sjekkpunkt.,

Bryst kreft cellelinjer utstilling endret S/G2/M celle syklus progresjon

i Løpet av den første G2/M checkpoint skjermen, flere cellelinjer utstilt et lavt MER (Tabell S1)., Fordi tolkningen av checkpoint funksjonen kan være nyttig i behandling av differensial vekst, celle-linje panelet ble vurdert for differensial mønstre av celleproliferasjon og/eller frigitt celle syklus progresjon kinetikk hensyn til iboende forskjeller i celle syklus fase lengde som kan påvirke tolkning av G2/M checkpoint funksjonalitet eksperimenter, og for å sikre at LumB feil i decatenation G2 checkpoint funksjon var ikke knyttet til iboende forskjeller i MER., Slike forvirrende virkninger tidligere har blitt rapportert, og er ofte på grunn av avhengigheten av noen checkpoint analyser på entall markører av celleproliferasjon.36

Tre tiltak av celleproliferasjon ble sammenlignet via flowcytometri, inkludert S-fase brøkdel som bestemmes av EdU-inkludering (S), den mitotic indeks (MI) målt ved MPM2+/4N DNA-innhold, og MER., Antall befolkningen doublings (PDLs) som oppstår under kontinuerlig kultur ble også bestemt ved å telle det totale antall celler i hver passering og beregning dobling av hver cellelinje (PDL/uke). I Fig. 3 a–d, den enkelte gjennomsnitt for hver cellelinje er avbildet og gruppert etter molekylær undertype. (Gjennomsnitt for hver celle linje ± SEM er gitt i Tabell S2).

I Fig. 3a, S-fase fraksjoner av Her2E og LumB undertyper dukket lavere enn de andre klassene., LMM analyse støttes observasjon av en nedgang i S for Her2E klasse, men nedgangen i LumB linjer var ikke statistisk signifikant, noe som tyder på at HMEC, BL, CL, og LumB klasser viser sammenlignbare prosenter av celler under DNA replikasjon. I Fig. 3b, BL celle linjer viser en økt MI i forhold til HMECs, og LMM analyse forsterket denne observasjonen tyder på at HMEC, CL, LumB, og Her2E klasser viser lignende MIs. I Fig., 3c, MER av BL, CL, og Her2E klasser var lavere enn HMEC klasse; disse observasjonene ble bekreftet av LMM analyse og foreslår at bare den HMEC og LumB klasser utstilt lignende MERs. I Fig. 3d, PDL målinger tyder på at LumB og Her2E undertyper har lavere PDLs, og LMM analyse bekrefte at begge klasser viste betydelig lavere PDLs i forhold til HMEC klasse., Den LumB klasse var sammenlignbar med HMEC klasse ved alle andre mål på celleproliferasjon, noe som indikerer at en MER sammenligningen av HMEC og LumB klassene var et hensiktsmessig tiltak av både decatenation og DNA-skade G2 checkpoint funksjon i LumB celle linjer. (**p < 0.05, FDR < 0.05)

Fordi gjennomføring av DNA-replikasjon er koblet til utbruddet av cellesyklus, samtidig øker i flere tiltak av celleproliferasjon (Fig., 3a–c) forventes å oppstå i celler som opprettholder strenge regulatoriske kontroll over S/G2/M celle syklus progresjon for å bevare en diploid genom.39, 40 Omvendt, kan dette forholdet ville bli forstyrret hvis celle syklus fase overganger ble frigitt. Dermed, to tilstøtende markører av celle syklus fase ble vurdert for tilstedeværelse av en correlative forhold,41 og et fravær av korrelasjon mellom de markører som skulle tilsi at overgangen mellom de to celle syklus faser var forsinket og/eller abnormt regulert.,

HMEC og LumB klasser vist en svært correlative forholdet mellom S-fase brøkdel og MI (p < 0.0001 og 0.0041, henholdsvis, Tabell 1), noe som tyder på at celle syklus overganger mellom S/G2/M faser følger en bestilt progresjon. Men, BL, CL, og Her2E klasser viste ingen correlative forholdet mellom S-fase brøkdel og MI tyder på at celle syklus progresjon blir forsinket eller abnormt regulert på et tidspunkt mellom initiering av DNA replikasjon og mitotic avslutt., For ytterligere å forbedre frigitt point(s) i celle syklus, S-fase brøkdel ble sammenlignet med den MER måling for å finne ut om S eller G2 progresjon ble forsinket. Bare HMEC klasse (p = 0.0006) viste en sammenheng mellom S og MER, alle av brystkreft cellelinje klasser vises isolering av S-fase brøkdel og MER tyder på at disse klassene kan tilbringe lengre perioder av gangen i S eller G2 faser, eller vise avvikende celle-syklus kontroll i S/G2., Til slutt, HMEC, LumB, og CL alle klasser utstilt en correlative forholdet mellom den tidsavhengige MER og MI (p = 0.012, p < 0.0001, og p = 0.0051, henholdsvis) som antyder at disse klassene opprettholde bestilt mitotic progresjon. I kontrast, BL og Her2E klasser viste ingen signifikant korrelasjon mellom MER og MI, som indikerer at disse klassene kan ikke svare på microtubule polymerisering inhibitor colcemid og/eller utstilling problemer med å fullføre mitose. (*p < 0.05, **p < 0.,05, FDR < 0.05)

Bare ikke-tumorigenic HMEC klasse utstilt en correlative forholdet mellom alle tre spredning markører, noe som tyder på at regulering av celle syklus i HMECs er koblet sammen, oppstår i et ordnet progresjon, og illustrerer godt kontrollert regulering av S/G2/M progresjon kinetikk i ikke-tumorigenic celler., I kontrast, bryst kreft cellelinjer som er utstilt dereguleringen av én eller flere forskjellige celle syklus faser noe som tyder på at S/G2/M progresjon var forsinket eller endret. BL og Her2E klasser vises ingen correlative relasjoner, noe som tyder på at flere feil i celle syklus regulering var til stede. Fordi dataene i Fig. 3a–d viser at Her2E klasse også viste lavere spredning priser i kultur i forhold til HMECs, vi er villige til å gjøre konklusjoner om celle syklus checkpoint funksjonen i celle linjer av Her2E klasse uten ytterligere data., I sammendraget, disse data tyder på at brystkreft undertyper er assosiert med endret regulering av S/G2/M progresjon, og at BL og CL klasser kan vise S/G2/M progresjon mangler som unngikk påvisning av MER analyse.,

CL og BL bryst kreft cellelinjer harbor side samhold feil; de SAC er svekket i BL bryst kreft cellelinjer

for Å finne ut om BL og CL klasser utstilt S/G2/M checkpoint mangler som ikke ble identifisert ved MER skjerm, metaphases ble analysert for å vurdere brutto kromosom struktur avvik som ofte er en indikasjon på checkpoint feil. Alle metaphases ble scoret i en blind måte, og kan for eksempel sprer seg er vist i Fig. 4a for en HMEC, BL og CL cellelinje., Totalt sett metaphases av LumB, og Her2E klasser utstilt tilsvarende sannsynlighetene for husing et samhold feil i forhold til HMEC klasse (Tabell S3A, p = 0.1674 og p = 0.4743, henholdsvis). I kontrast, CL og BL klasser dukket opp for å vise en økt sannsynlighet for mye samhold mangler som varierte fra mild til alvorlig (Fig. 4a).

på Grunn av den variable utvalg av samhold feil alvorlighetsgrad, metaphases ble undersøkt via en høy følsomhet fluorescens in situ hybridisering (FISH) – analysen benytter en probe som er rettet mot centromere av kromosom 9 (CEP9) for å bekrefte tilstedeværelse av samhold feil og vurdere alvorlighetsgraden i BL og CL-klasser., I diploid metaphase celler med riktig cohered søster kromatidene, den centromeres av søster kromatidene er så tett sammen at de ser ut til å være et enkelt CEP9 locus på FISK farging. Imidlertid, i celler som viser samhold mangler, centromeric regioner av søster kromatidene er skilt, og viser en dublett mønster som inneholder to visuelt tydelig CEP9 loci. Grad av samhold feil ble definert som mild, moderat eller alvorlig,42 og eksempler er vist i Fig. 4b med hvite pilene indikerer hver type samhold feil., BL og CL klasser både utstilt økning i den totale andelen av celler med samhold feil, noe som tyder på at disse klassene kan oppleve problemer med å fullføre DNA replikasjon og/eller oppdeling søster kromatidene like til dattercellene. Videre er fordelingen av samhold feil alvorlighetsgraden i begge klasser er også ulik i forhold til HMECs, noe som tyder på at et økt antall av moderat/alvorlig samhold mangler som ble funnet i disse klassene (Fig. 4b, nedre panel)., I tillegg, både BL og CL klasser viste betydelig høyere prosenter av celler med kromosomavvik hos sammenlignet med HMECs (>4 CEP9 foci per metaphase), noe som tyder på at samhold defekter kan føre til upassende segregering av dupliserte kromosomer under cytokinesis og bekrefter tilstedeværelsen av genomisk ustabilitet i disse klassene (Fig. S2 og Tabell S3B).

Fordi MERs i CL og BL klasser var lave i forhold til HMEC klasse (Fig. 3c), tilstedeværelse av samhold mangler (Fig., 4a, b) tidligere har blitt vist å aktivere SAC,43 og alvorlig kromosomavvik hos ble observert i begge klasser (Tabell S5B, Fig. S2), det var mulig at den BL og CL klasser hatt SAC feil. Dermed antall mitotic cellene som er akkumulert i løpet av en 24 timers periode i nærvær/fravær av colcemid ble målt ved flowcytometri.,19, 44 av Denne analysen gir oss mulighet til å skille mellom celle linjer som viser et lavt MER på grunn av langsom bevegelse gjennom S og/eller G2 fasen (betydelige nivåer av mitotic akkumulering i nærvær av colcemid vises over 24 h) og cellelinjer som mangler en funksjonell SAC (ingen mitotic akkumulering på grunn av en manglende evne til å arrest i colcemid). Eksempel flowcytometri profiler for MCF10As (HMEC) og MDA-MB-468s (BL) er vist i panelet til venstre i Fig. 4c., Tillegg på 100 ng/mL colcemid dramatisk økt antall mitotic celler i MCF10As, mens antall mitotic celler redusert i MDA-MB-468s (Fig. 4c, midten paneler). Den gjennomsnittlige økningen i mitotic indeks for hver celle linje gruppert etter egenverdi molekylær undertype er vist for tre uavhengige eksperimenter (høyre panel, Fig. 4c). Enkelt celle linje gjennomsnitt er gitt i Tabell S4. Både BL og Her2E klasser viste seg å ha en defekt SAC, og LMM-analyser bekreftet at SAC funksjonen ble redusert i BL klasse., Selv om en BL cellelinje (SUM149) utstilt noen mitotic akkumulering i nærvær av colcemid, dette resultatet er sannsynligvis på grunn av tilstedeværelsen av en subpopulasjon av CL-celler som finnes i denne cellen linje.34 Tatt sammen, og disse dataene tyder på at den kombinerte samhold feil og avvikende SAC funksjon identifisert i BL klasse, kan bidra til de høye nivåene av genomisk ustabilitet observert i BL brystkreft., Tilstedeværelsen av en effektiv SAC i CL-klasse tyder på at samhold feil i disse cellelinjene er i stand til å aktivere de SAC, og at alvorlige kromosomavvik hos observert er trolig på grunn av en alternativ mekanisme av genomisk ustabilitet. (*p < 0.05, **p < 0.05, FDR < 0.,05)

En decatenation G2 checkpoint genuttrykk signatur korrelerer med kliniske utfall av brystkreft pasienter

for Å finne ut om checkpoint feil som er identifisert i cellen linje panelet var assosiert med kliniske utfall, et gen uttrykk signatur av decatenation G2 checkpoint funksjon ble identifisert fra cellelinje-panelet ved hjelp av kvantitativ egenskap analyse (QTA) (Tabell S5)., Denne signaturen ble brukt til METABRIC kliniske data settet, som inneholder ca 2000 bryst svulst prøver som inkluderer kliniske kommentarer, iboende molekylær subtyping informasjon, og gene expression data.45 I en univariate analyser decatenation G2 checkpoint signatur var signifikant assosiert med bedre total overlevelse i alle brystkreft svulster (HR: 0.7391, CI: 0.5759–0.9486, logg grad p = 0.0176, Fig. 5a). I en multivariat analyse, inkludert den iboende molekylær undertyper, sjekkpunktet signatur var ikke signifikant assosiert med total overlevelse (HR: 0.,76843, CI: 0.5769–1.023, logg grad p = 0.071673), men var nær signifikant.

decatenation G2 checkpoint signatur var også logisk av OS utfall i LumA pasienter (HR: 0.6039, CI: 0.4559–0.7998, p = 0.01741, Fig. 5b), noe som tyder på at nedsatt decatenation G2 checkpoint funksjon kan bidra til dårlige resultater i LumA undertype. Median decatenation G2 checkpoint signatur for alle brystkreft svulster variert mellom undergrupper (p = 1.73 e–133, Fig., 5c) med LumB undertype å uttrykke den lavest median checkpoint signatur; denne observasjonen ble uavhengig verifisert ved hjelp av UNC337 data set (p = 8.46 e–20, Tabell S6).27 Selv om den decatenation G2 checkpoint signatur var ikke signifikant assosiert med resultater innenfor LumB undertype (p = 0.597, Tabell S6), kan dette være på grunn av den iboende lav median decatenation G2 checkpoint signatur i denne undertypen., For eksempel, hvis flertallet av LumB svulster er defekt for decatenation G2 checkpoint-funksjonen, kan det ikke være nok variasjon av signatur i LumB undertype for å forutse utfall. Til sammen utgjør disse dataene antyder at decatenation G2 checkpoint kan være en klinisk relevant mål for behandling av LumA og/eller LumB brystkreft pasienter.