Frontiers i Bioengineeringand Bioteknologi

Mesenchymal Stromal Celler

Siden beskrevet av Friedenstein (Friedenstein et al., 1966), mesenchymal stem/stromal celler (MSCs) har vært fokus for forskning innsats for å utnytte deres terapeutiske potensial. På grunn av deres immun-unnvikende natur, MSCs utgivelsen immunmodulerende faktorer som tillater dem å flykte avvisningsmekanismer for tilstrekkelig tid til å utøve sin terapeutiske tiltak (Ankrum et al.,, 2014). MSCs også uttrykke et utvalg av cytokin og chemokine reseptorer, slik som CXCR4, CXCR7, og CCR7, slik at overføring til nettsteder av skader og betennelser (Sasaki et al., 2008; Liu et al., 2012).

Som et paradigme for vev regenerering, MSCs har vært brukt i mange ortopediske tilstander, inkludert artrose （OA). Den første vellykkede behandlingen brukes en caprine modell av OA involverer fremre korsbånd transection kombinert med total mediale meniscectomy (Murphy et al., 2003)., Direkte intra-artikulære (IA) levering av autologous bein marg (BM)-MSCs, 6 uker etter skade, førte til menisk reparasjon og chondro-beskyttelse. Grønt fluorescerende protein (GFP)-transduced celler ble synlig i synovial kapsel, fett pad og nydannede menisken, men ikke i leddbrusk. Dette arbeidet ledet til hypotesen om at MSCs handle via alternative mekanismer for å cellen erstatning dvs., trofisk mekanismer for å fremme vev regenerasjon gjennom modulering av verten miljø og/eller stimulering av endogene forfedre (Jeong et al., 2013)., Studien ble senere godkjent i andre prekliniske modeller av OA (Barry og Murphy, 2013). I generelt er, denne fenomen overføringer til andre sykdom scenarier, som gjennomgås grundig av Prockop et al. (Prockop, 2009). Mer nylig, fase i studier har skaffet bevis for at MSCs også har klinisk nytte i modulerende OA (Jo et al., 2014; Pers et al., 2016); en rekke upubliserte Fase 2-studier er løpende vurdering adipose-avledet MSCs i OA inkludert ADIPOA2 (http://adipoa2.eu/).,

MSCs forsvinne fra målet vev raskt etter inntak, men er fortsatt i stand til å levere chondroprotective og immunmodulerende effekter (ter Huurne et al., 2012). Siden deres terapeutiske effekten synes å være uavhengig av deres engraftment, det er nå ansett for å være hovedsakelig parakrine-mediert. Den stadig mer akseptert modell er at MSCs er funnet sovende i vivo som pericytes (Crisan et al., 2008). Disse deltar i utvikling av vev, inkludert synovium, og er involvert i vev reparasjon i voksen livet (Roelofs et al., 2017)., Når aktivert i respons til signaler som er forbundet med den skadde miljø, slik som pro-inflammatoriske cytokiner, et fenomen som er vanligvis referert til som «lisensiering» de skiller faktorer, inkludert chemokines og cytokiner, å etablere en regenerativ miljø. Avhengig av miljøet i den spesifikke sykdommen, anti-apoptotic og anti-fibrotic faktorer kan begrense omfanget av skaden for å forbedre vev helbredende (Ryan et al., 2017). Vev-iboende forfedre blir bedt om å spre og differensiere, mens chemoattractants rekruttere endogene forfedre til nettstedet for skader., Samtidig, aktiveres MSCs er i stand til modulerende immunforsvaret lokalt ved selektiv hemmer spredning av immunceller (Aggarwal og Pittenger, 2005) (Figur 1). Dette papiret vil se bevis for disse terapeutiske effekter i modeller som er relevante for å OA, enten in vivo eller in vitro (oppsummert i Tabell 1). Det vil være avgjørende i fremtiden for å bekrefte disse funnene ved hjelp av ferske isolert stromal celler.

MSC Secretome

MSCs viser en rik secretory profil som forsterkes av eksponering for inflammatorisk signaler. En proteomics tilnærming identifisert 118 proteiner differentially uttrykt av menneskelig adipose-avledet stamceller (ASCs) ved tumor nekrose faktor (TNF)-α stimulering (Lee et al., 2010)., Disse inkluderte mange cytokiner og chemokines , proteases og proteasehemmere , ekstracellulære matriks (ECM) molekyler og faktorer som er involvert i immunforsvaret regulering og celle-signalering.

Apoptosis

Chondrocyte apoptosis har vært forbundet med degenerative OA i mange år (Aigner et al., 2004; Del Carlo og Loeser, 2008)., Selv om det er ingen rapporter om direkte anti-apoptotic virkninger av MSCs i sammenheng med OA, indirekte bevis tyder på at exosomes innhentet fra menneskelig MSCs, og ved slutning består av utskilt faktorer, hemmet IL-1β-induced apoptosis av ex vivo-kultivert OA chondrocytes (Liu et al., 2018a). I tillegg, MSC-avledet exosomes fremmet chondrocyte spredning i en rotte modell av OA, ved å blokkere miR-206 med lncRNA-KLF3-AS1 (Liu et al., 2018b)., Til tross for løselig faktorer som ikke ble vist i modeller av OA, MSCs svarte på to forskjellige apoptotic celle linjer in vitro ved økt uttrykk og sekresjon av anti-apoptotic hormon stanniocalcin (STC)-1 (Block et al., 2009). Fremtidig arbeid som ser på felles-forbundet MSC anti-apoptotic virkninger er sannsynlig å identifisere direkte mediatorer av prosessen.

Fibrose

Maumus et al. co-kultivert autologous ASCs med chondrocytes avledet fra OA pasienter i en transwell system (Maumus et al., 2013)., Forfatterne observert en klar nedgang i uttrykk nivåer av hypertrofisk og fibrotic markører MMP-13, alkalisk fosfatase, Runx2, collagens type i, III, VI og vimentin, samt en 40% økning i FORETAK-β1 sekresjon. Ved hjelp av en nøytraliserende antistoff, HGF ble identifisert som den viktigste formidler av den anti-fibrotic effekt. Disse dataene er av særlig relevans som HGF konsentrasjon i synovialvæsken har en direkte sammenheng med alvorlighetsgraden av OA (Dankbar et al., 2007). MSCs også hemme fibrosis in vivo gjennom bFGF (Suga et al. 2009) og adrenomedullin (Li et al., 2009)., I tillegg er en rekke studier har foreslått at in vivo-administrert MSCs utskilt TSG-6 og indirekte forhindret fibrose ved å undertrykke tidlig inflammatorisk respons til ulike sykdommer andre enn OA, inkludert myocardial infarction (Lee et al., 2009), peritonitis (Choi et al., 2011), betennelse i hornhinnen (Oh et al., 2010), og hornhinnen allograft avvisning (Oh et al., 2012).

Vev Metabolisme

Blant andre aktiviteter, MMPs bryte ned ECM og er regulert av spesifikke hemmere kalt TIMPs., I OA, balansen mellom anabolske og katabolske faktorer er forstyrret i favør av sistnevnte (Lohmander et al., 1993). MMP-2,-9, og -13 ble oppdaget på et høyere nivå i menneskelig OA brusk i forhold til friskt vev (Jackson et al., 2014). Videre, redusert MMP-13 korrelert med forbedret osteochondral reparasjon i rotter behandlet med doxycycline (Lee H. et al., 2013) og MSCs constitutively utsondre høye nivåer av TIMP-2 og -1, som hemmer MMP-2 og MMP-9, henholdsvis., Under patologisk stress (IL-1β, TNF-α, hypoksi) TIMP-1 sekresjon er oppregulert for å motvirke økt katabolske aktivitet (Lozito og Tuan, 2011). I tillegg, MMP-hemming er ikke bestemt; TIMP-1 kan hemme de fleste MMPs (Visse og Nagase, 2003), noe som gjør MSCs en enda mer allsidig verktøy for å gjenopprette den metabolske balansen dårligere og brusk.

Chondrogenesis

Matricellular proteiner, utskilt matrix proteiner med regulatoriske roller, binder seg til ECM og fungere som reseptorer for celle-til-overflate-molekyler, vekstfaktorer og MMPs (Bornstein et al., 2000)., Thrombospondin (TSP2), for eksempel, er en kjent regulator av brusk og bein differensiering og skilles ut av MSCs å indusere spredning via autocrine mekanismer (Hankenson og Bornstein, 2002). TSP2, utskilt av menneskelig navlestreng blod-avledet (UCB)-MSCs behandlet med synovial væske fra OA pasienter, indusert differensiering av chondroprogenitor celler. Det fremmes brusk fornyelse i en kanin i full tykkelse osteochondral-defekt modell (Jeong et al., 2013)., TSP2 ble funnet å ha en autocrine action på menneskelig UCB-MSCs, BM-MSCs og ASCs, fremme brusk differensiering og hindre hypertrofi (Jeong et al., 2015). Selv om data er begrenset, er det tegn til at TSP2 er en av de viktigste parakrine spillere i MSC-mediert brusk fornyelse.

Immunsuppresjon

Den rollen betennelse i etablering og vedlikehold av OA er nå allment akseptert (Ayral et al., 2005) med synovial membran betennelse et kjennetegn på OA patologi (Goldring, 1999; Pelletier et al., 2001)., Histologiske studier viser at OA-pasienter har variabel grad av synovitt, med høyere nivåer av pro-inflammatoriske cytokiner og infiltrasjon av immunceller, hovedsakelig makrofager (Benito et al., 2005). Biologiske markører for betennelse positivt korrelerer med knesmerter (Baker et al., 2010; Scanzello et al. 2011) og klinisk forløp av sykdommen (Krasnokutsky et al., 2011; Roemer et al., 2011)., Lisensiert MSCs utsondre en rekke anti-inflammatoriske cytokiner som kan bidra til å re-etablere en likevekt i den betente synovium: MSC-kondisjonert medium (CM) redusert produksjon av inflammatoriske mediatorer i OA felles explants (van Buul et al., 2012).

Di Nicola et al. først vurdert potensialet for allogen MSC avvisning i en blandet lymfocytt reaksjon (MLR). I stedet for fremkaller en immunrespons, cellene undertrykt spredning av T-celler (Di Nicola et al., 2002; Krampera et al., 2003)., Relevansen av MSC-utskilt faktorer i immunomodulation ble vist av kapasiteten av deres supernatant for å viderekoble immunceller fra skadet organer (Parekkadan et al., 2007). I dag, MSCs er under vurdering i en rekke kliniske forsøk for mange inflammatoriske tilstander (Trounson og McDonald, 2015).

En av de viktigste effektorer av MSC-mediated immune-undertrykkelse er prostaglandin-E2 (PGE2). PGE2 er constitutively skilles ut av MSCs og produksjonen er dramatisk forbedret via stimulering av interferon (IFN)-γ, TNF-α (engelsk et al., 2007), eller IL-1β (Chen et al., 2010)., PGE2 negativt påvirker spredning av T- (Martinet et al. 2009) og natural killer (NK) celler (Sotiropoulou et al., 2006), fører til en økning i bassenget av regulatoriske T (Treg) celler, stimulerer makrofager til å produsere IL-10 og hindrer monocytter fra differensiere i dendrittiske celler (DCs) (Aggarwal og Pittenger, 2005). I OA, PGE2 formidler ASC terapeutiske effekter og er en regulerende sjekkpunkt i immun-modulasjon. Manfredini et al., bevis at PGE2/COX2 vei er ansvarlig for induksjon av IL-10 og hemming av TNFa og IL-6 for å indusere et M2-bryteren i menneskelig synovial makrofager (Manferdini et al., 2017).

Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) catalyzes nedbryting av tryptofan, forårsake undertrykkelse av T-celler. Det er ansatt av DCs til å modulere immunsystemet (Mellor og Munn, 2004), men kan skilles ut av MSCs på IFN-γ-stimulering (Krampera et al., 2006). I en menneskelig MLR, IFN-γ-indusert uttrykk for IDO i MSCs var ansvarlig for undertrykkelse av T-celle spredning (Meisel et al., 2004)., Det er også stasjoner M2 polarisering i makrofager og induserer en tolerogenic fenotypen i DCs og Tregs (Ge et al., 2010; Sica og Mantovani, 2012). Dens betydning i MSC-mediert immunsuppresjon har blitt validert ved hjelp av spesifikke hemmere og knockout MSCs (Krampera et al., 2006; English et al., 2007; Spaggiari et al., 2008).

TNF-inducible genet (TSG)-6 er kjent for sine mange og varierte anti-inflammatoriske mekanismer (Wisniewski og Vilcek, 2004). Produsert i respons til inflammatorisk signaler, det har en sentral rolle i MSC-mediert immunsuppresjon (Lee et al., 2009)., På den annen side, det ble identifisert som en av de mest betydelig opp-regulerte gener i det menneskelige OA leddbrusk (Chou et al., 2015) og foreslått som en sykdom som biomarkør, som sin aktivitet i synovialvæsken spådd OA progresjon (Wisniewski et al., 2014). TSG-6 har en kompleks rolle i brusk patologi, som er involvert i matrix montering under syntese av nytt vev (Chou et al., 2018).

Rollen Apoptotic MSCs

Når administreres, MSCs kan gjennomgå biologiske endringer mer radikal enn differensiering eller lisensiering. Toupet et al., observert at de fleste MSCs forsvinne 10 dager etter IA-injeksjon i en murin modell av OA, med lignende resultater som oppnås med syngeneic og xenogenic menneskelige ASCs (Toupet et al., 2013, 2015). Til tross for død og rydding av administrert celler, betydelig terapeutisk effekt er observert i respons til IA injeksjon av musen ASCs (ter Huurne et al., 2012; Schelbergen et al., 2014).

Apoptotic celler kommuniserer med immunceller gjennom to ulike mekanismer: direkte effekter forbundet med apoptotic cellene seg selv og indirekte effekter utløses i phagocytizing celler (Figur 2)., Direkte effekter omfatter sekresjon av IL-10 og FORETAK-β, genererer en immunsuppressiv microenvironment (Chen et al. I 2001; Korns et al., 2011). Dette miljøet hemmer lipopolysaccharide (LPS)-stimulert makrofager fra sekresjon IL-1β og TNF-α (McDonald et al., 1999). Indirekte virkninger er knyttet til eliminering av apoptotic celler ved phagocytes, noe som resulterer i redusert reaksjonsevne for å LPS (Perruche et al. 2009) og en overgang til en anti-inflammatorisk profil (Fadok et al., 1998)., Immunceller som internalisere apoptotic cellene ikke klarer å indusere CD4+ T-hjelper-celler, forlater effector lymfocytter i en «hjelpeløs» state (Griffith et al., 2007) og indusere clonal utvidelse av Foxp3+ Treg-celler (Xia et al., 2007; Perruche et al., 2008).

ved Hjelp av en murin modell av graft-versus,-vert-sykdom (GvHD), forskere vist at tilført MSC apoptosis er indusert av mottakeren T-celler gjennom celle-til-celle kontakt med utgivelsen av perforin – og granzyme B-som inneholder partikler (Galleu et al., 2017). Phagocytes ble også vist å ha en viktig rolle å produsere IDO på engulfing apoptotic MSCs. Når disse komponentene ble slått ned eller hemmet, den terapeutiske effekten av MSCs var tapt. Viktigst av alt, infusjon av MSCs gjengitt apoptotic ex vivo restaurert terapeutiske effekter. Det er interessant at pasienten respons til MSCs korrelert med deres cytotoksiske kapasitet., Disse funnene gir bevis for at apoptosis er en av de drivende mekanismen av MSC-mediert immunsuppresjon.

FORETAK-β-mediert toleranse induksjon er de mest vanlig rapporterte mekanisme i pre-kliniske studier av ekstrakorporal photopheresis, administrasjon av leukocytter gjengitt apoptotic ex vivo. En sterk immunmodulerende effekt ble observert i inflammatorisk artritt (Michlewska et al., 2009; Perruche et al. 2009) og photopheresis er en godkjent behandling for kutane T-celle lymfom og GvHD (Weitz et al., 2015)., Apoptosis kan også representere en viktig del av MSC-terapi i OA. Upubliserte data i vårt laboratorium viser så lav som 1.6% MSC-engraftment 3 dager etter at IA administrasjon av GFP+ MSCs i murin OA knær. Fluorescerende celler ble ikke påvist i noen tilstøtende vev, inkludert lokale lymfeknuter. Dette styrker hypotesen om at det celler kunne gjennomgå apoptosis og modulere betennelse med påfølgende beskyttelse fra OA utvikling. Mens, apoptosis post-infusjon er en forbigående hendelse, Galleu et al., viste at den påfølgende svar kan representere en omprogrammering av visse aspekter vertens immunsystem (Galleu et al., 2017).

Leter Videre: Ekstra-Mobil Blemmer

parakrine virkningen av MSCs er ikke begrenset til løselig faktorer. MSCs, som mange andre celler, har vist seg å produsere ekstracellulære blemmer (ECVs) (Lai et al., 2010), små strukturer vedlagt i et fosfolipid bilayer, bærer mange cytoplasma komponenter., ECVs er involvert i intercellulær kommunikasjon gjennom horisontal overføring av mRNA og protein og er gruppert basert på størrelse, med ulik sammensetning og biogenese. Exosomes varierer mellom 40 og 100 nm i diameter. De er constitutively utgitt fra slutten av endosomal batterirommet ved fusjon av multivesicular organer med plasma membran, men produksjonen kan øke ved cytoskeleton aktivering. Exosomes er preget av proteiner er nødvendig for deres dannelse og transport, slik som tetraspanins, Alix og tumor mottakelighet genet 101., Microvesicles er en heterogen befolkning på ECVs mellom 100 og 1000 nm generert via direkte spirende ved aktivering av en stress-signal, som endrer fosfolipid balanse av membranen og danner lipid flåter. Microvesicles er preget av membran markører som er spesifikke for den overordnede cellen. I prekliniske modeller, ECVs ble observert å ha anti-apoptotic (Bruno et al., 2012), anti-fibrotic (Li et al., 2013), pro-angiogenic (Bian et al., 2014), og anti-inflammatoriske effekter (Lee et al., 2012)., MSC-avledet ECVs føre generasjon av Tregs, hindre spredning av lymfocytter (Mokarizadeh et al., 2012), makrofager (Zhang et al., 2014), og B-celler (Budoni et al., 2013). Imidlertid, ECVs alene kan ikke levere samme immunmodulerende effekter av foreldrenes celler, med celle-celle kontakt fortsatt nødvendig å modulere lymfocytt-spredning og funksjon (Conforti et al., 2014).

MSC-avledet ECVs produsert lovende resultater i rotte modeller av osteoporose (Qi et al., 2016) og osteochondral feil reparasjon (Zhang et al., 2016). Mer nylig, har MSC-ECVs ble testet i OA-modeller., Exosomes avledet fra synovium MSCs og induserte pluripotente stamceller svekket sykdom score i en kllagenase-indusert OA (CIOA) mus modell, ved å fremme chondrocyte spredning og migrasjon (Zhu, et al., 2017). Spesielt, exosomes avledet fra synovial MSCs overexpressing miR-140-5p indusert spredning av chondrocytes in vitro. Når det gis i en rotte modell av OA progresjon av sykdommen og brusk degenerasjon ble betydelig forsinket (Tao et al., 2017). Cosenza et al. levert MSC-ECVs i en CIOA modell og rapportert redusert felles skade (Cosenza et al., 2017)., Bruk av MSC-ECVs som en terapi for OA ville gi mange fordeler i forhold til celle-avledede produkter, unngå bekymringer over mulige ondartet transformasjoner. Imidlertid kan det oppstå problemer med ECV produksjon som de trenger for å være spesielt skreddersydd for indikasjon for å bli behandlet. I tillegg, deres produksjon er ennå ikke blitt standardisert for klinisk produksjon, som er tilfellet for mobil produkter.

Konklusjon

Rapporter som er oppsummert her, tyder på et betydelig potensial for bruk av MSCs eller MSC-CM i OA., In vitro, co-kultur av OA chondrocytes med ASC-CM resulterte i NF-kB-mediert cytoprotective effekter via forbedret produksjon av kollagen II, hemming av IL-6, TNF og ulike MMPs, samt upregulation av IL-10 (Platas et al., 2013). På samme måte, ved hjelp av OA brusk explants, MSC-CM ble vist å forstyrre NF-kB vei til å megle anti-inflammatorisk og anti-katabolske effekter (van Buul et al., 2012). MSCs har allerede vist seg å være et verdifullt verktøy for mange forhold, blant annet akutt GvHD (Le Blanc et al. 2008) og multippel sklerose (Karussis et al., 2008).,

Fase i kliniske studier har vist at sikkerheten av direkte IA administrasjon av MSCs i OA pasienter (Centeno et al., 2008; Davatchi et al., 2011). I 2012, smerte reduksjon ble rapportert opp til 6 måneder etter injeksjon av 20-24 millioner MSCs, med økt brusk tykkelse og reduksjon av edematous subchondral flekker i tre av seks pasienter (Emadedin et al., 2012). Jo et al., injisert høyere doser av ASCs (opptil 10 × 108), skaffe betydelig forbedret WOMAC score med en klinisk meningsfull smerte reduksjon og, viktigst av alt, regenerert hyaline leddbrusk i de mest alvorlig utartet området i kneet (Jo et al., 2014). I ADIPOA rettssaken, en enkelt dose på 2 millioner ASCs betydelig forbedret smerte nivåer og funksjon (Pers et al., 2016).

I sammendraget, MSCs kan handle gjennom en hit-and-run mekanisme snarere enn stabilt engrafting i vevet., Obduksjoner av pasienter som fikk MSC IV infusjoner for ulike forhold innen et år før døden bekrefte at donor MSCs er ikke normalt beholdes i en rekke vev. Påvisning av donor DNA ikke korrelerer med grad av HLA mismatch eller klinisk respons, noe som tyder på at klarering er ikke immun-mediert (von Bahr et al., 2012). Men rollen som celledød i formidling av den terapeutiske effekten av MSCs behov for ytterligere etterforskning og fenotype og aktivitet i celler som overlever, selv for en kort tid på stedet med implantasjon belyst.,

Forfatter Bidrag

PM: bidratt til utviklingen av konseptet som underbygger anmeldelse, forsket på relevant litteratur, og skrev kroppen av omtalen, SR: også bidratt til begrepet innsending og hjalp til med å skrive, AG: undersøkt litteraturen om apoptosis; JMM: deltok i manuskriptet forberedelse, pågående og siste gjennomgang av materiale; FB: deltok også i manuskriptet oppfatning og vurdering.

Midler

PM er finansiert av Science Foundation Irland gjennom Cúram (Stipend ingen., 13/RC/2073) og den Irske blodoverføring Service. SR er finansiert av en NUI Galway Hardiman stipend. JMM og FB av den Europeiske Union (H2020 PHC16-2015, gir ingen. 667932; H2020-PHC-2014-2015, gir ingen. 643809) og av Science Foundation Irland gjennom Cúram (Stipend ingen. 13/RC/2073).

interessekonflikt Uttalelse

forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller finansielle forhold som kan oppfattes som en potensiell interessekonflikt.

Erkjennelsene

Vi vil gjerne takke Maciek Doczyk for å utforme tallene.,