Grenzen in der Mikrobiologie

Alte Geschichte

Wohl begann die Wissenschaft der mikrobiellen Physiologie, als Leeuwenhoek zum ersten Mal vom Anblick von Vorticella fasziniert wurde, die ihre Zilien schlug. Ich schlage vor, dass wie die meisten Beobachtungen von Mikroben, von den einfachsten bis zu den anspruchsvollsten, diese eine physiologische Komponente hat., Jahrhunderts wurde dieses neue Untersuchungsgebiet mit Entdeckungen von Prozessen wie Anaerobiose und Sporulation sowie der Erkennung der Fermentation als mikrobiologisches Phänomen auffällig und erkennbar. Bald darauf kamen die Studien von Winogradsky und seinen Anhängern zu den chemischen Veränderungen in der Umwelt, die sich aus mikrobiellen Aktivitäten ergeben. Jahrhunderts, leistete die mikrobielle Physiologie einen wichtigen Beitrag zur Biochemie und spielte eine Schlüsselrolle bei der Aufklärung des zentralen Stoffwechsels.,

Das Verständnis der Physiologie des Bakterienwachstums blieb jedoch zurück. Selbst in den frühen 1950er Jahren war ein Student der Mikrobiologie, wie ich, der verstehen wollte, was passiert, wenn Bakterien wachsen, schwer zu finden nützliche Wegweiser. In den Lehrbüchern des Tages lag der Fokus auf der Wachstumskurve mit ihrer deprimierend unverständlichen Abfolge von Phasen und der Implikation, dass sie Phasen eines obligatorischen Lebenszyklus darstellten. Doch schon in den frühesten Tagen der Mikrobiologie gab es Leuchttürme des klaren Denkens zu diesem Thema., Einer der ersten Studenten von Pasteur, Raulin (1869), führte quantitative Wachstumsexperimente mit dem Schimmelpilz Aspergillus niger durch, die überraschenderweise seine Fähigkeit zeigten, auf einem einfachen Zucker und einigen Mineralsalzen zu wachsen. Das minimale Medium von Raulin unterscheidet sich nicht sehr von denen, die heute verwendet werden. Pasteur selbst glaubte fast obsessiv, dass die Morphologie und Aktivitäten von Mikroben durch ihre Umgebung bedingt sind.

Mit der Zeit sammelte sich eine umfangreiche Literatur über Wachstumsexperimente, einige phantasievoll, andere genau in der Absicht und akribisch in der Ausführung., Bemerkenswert für seine Klarheit des Denkens ist Henricis klassischer Henrici (1928) Bericht darüber, wie sich Bakterien während ihres Wachstumszyklus in der Größe verändern. Trotz solcher Beispiele für kluge Einsichten umhüllte ein Nebel weiterhin die Wachstumsphysiologie, angeheizt von skurrilen Vorstellungen. Zum Beispiel dachten einige, dass die Ausbeute an Bakterienkulturen durch eine Entität namens „biologischer Raum“ begrenzt sei.“Andere sahen die Wachstumskurve als unaufhaltsam S-förmig an, was durch die erstmals von Pierre Verhulst (1845) veröffentlichte logistische Gleichung bestimmt wurde. (Ich bin auf Leute gestoßen, die das bis heute glauben.,) Während dieser Zeit herrschte die Heiligkeit der Wachstumskurve. In einem 1949 Review on Growth erklärte sogar Van Niel (1949): „Fast alles, was über die Kinetik des Wachstums von Mikroorganismen bekannt ist, wurde aus Studien sogenannter Wachstumskurven gelernt.“

Jüngere Geschichte

Der Nebel begann sich mit der Arbeit von unter anderem zwei Personen zu erheben, die später Väter der Molekularbiologie wurden, Alfred Hershey in den späten 1930er Jahren und Jacques Monod in den 1940er Jahren (Abbildungen 1, 2)., Hershey (Hershey, 1939) (in Zusammenarbeit mit seinem Vorsitzenden Jacques Bronfenbrenner) konterte die Verwendung einer Kultur in der ersten Wachstumsphase als Impfstoff, um eine neue Kultur zu gründen, und zerstritt so die unantastbare Heiligkeit der Wachstumskurve. Monod (1942) versendete die Wachstumsreaktion ganzer Kulturen auf die Enzymkinetik und zeigte, dass die Wachstumsrate auf Michaelis–Menten-Weise von der Substratkonzentration abhängig war, während die Ausbeute proportional zur verfügbaren Substratmenge war., Diese Experimente wurden mit Kulturen durchgeführt, die in einem stabilen Zustand wachsen, ein wichtiger Punkt, auf den ich in Kürze zurückkehren werde. Monod, wahrscheinlich unzufrieden mit der vorherrschenden Sichtweise des Feldes als oberflächlich, suchte bald anderswo nach molekularen Mechanismen. Es ist bemerkenswert, dass seine Studien zur Regulation der Genexpression aus seiner wachstumsphysiologischen Arbeit zum „diauxischen Wachstum“ entstanden sind, einem Phänomen, bei dem Glukose im Medium das Wachstum anderer Zucker behindert., Er hinterließ einen umfassenden, aber abweisenden Abschiedsschuss (Monod, 1949): „Das Studium des Wachstums von Bakterienkulturen stellt kein spezialisiertes Thema oder Forschungszweig dar: Es ist die grundlegende Methode der Mikrobiologie.“Als Disziplin kam die Physiologie des Bakterienwachstums dem Übergang von Verwirrung in Vergessenheit in einem einzigen Sprung nahe.

Wie es manchmal der Fall ist, wurde die nachfolgende Arbeit durch eine klare Definition erleichtert. In Campbell (1957) vorgeschlagen, dass die Steady-State-Wachstum Bedingung als „ausgewogenes Wachstum bezeichnet werden.“Dabei hat er die bisher nur eine Phase der Wachstumskurve (die Logphase) zu einem Gesamtkonzept erhoben. In gewissem Sinne ist der Übergang von der Beobachtung der Log-Phase zum Konzept des ausgeglichenen Wachstums so, als würde man Äpfel fallen sehen und an die Schwerkraft denken., Zellen in ausgewogenem Wachstum erreichen die maximale Wachstumsrate, die für dieses bestimmte Medium möglich ist. Man kann sich vorstellen, dass der am meisten geschätzte Ehrgeiz eines Bakteriums darin besteht, so schnell wie möglich zu wachsen und damit weniger produktive Konkurrenten zu übertreffen. Aber ausgewogenes Wachstum hat ein weiteres wichtiges und einzigartiges Merkmal: Es ist die einzige leicht reproduzierbare Wachstumsbedingung. Überlegen Sie, wie variabel im Laufe der Zeit alle anderen Zustände im Wachstum einer Kultur sind. Probe jetzt und Probe ein paar Minuten später, und Sie finden, dass die Zellen bereits unterschiedliche Eigenschaften haben., Leider wird dieser einfache Punkt auch jetzt nicht immer bei der Definition von Forschungsprotokollen berücksichtigt. Siehe eine begründete Exkoriation, die auf die Praktizierenden der schlampigen Kultivierung von Neidhardt (2006) abzielt. Eine unermessliche Menge an Arbeit, die mit Kulturen in unbestimmten Wachstumsstadien geleistet wird, ist nicht reproduzierbar und wird daher verschwendet.

Die Bedeutung des Wachstums in einem stetigen Zustand war früher erkannt worden, aber Campbells neuartiger und präziser Begriff half, die Aura der Unveränderlichkeit aus der Wachstumskurve zu entfernen., Es bot die Freiheit, Kulturen zu manipulieren, indem es sie beispielsweise wiederholt verdünnte, um sie in ausgewogenem Wachstum zu halten. Eine der interessantesten dieser Manipulationen in den frühen 1950er Jahren war die Entwicklung kontinuierlicher Kulturen in Chemostaten (Monod, 1949; Novick und Szilard, 1950).

Mitte der 1950er Jahre wurde die Wachstumsphysiologie auf eines der Hauptanliegen des Tages ausgeweitet: die Beziehung von Nukleinsäuren zur Proteinsynthese. Hier ändert sich diese Erzählung zu einem eher selektiven, persönlichen Konto. 1956 trat ich in das Labor von Ole Maaløe in Kopenhagen ein (Abbildung 3)., Schließlich sollte viel Arbeit an der Wachstumsphysiologie aus seinem Labor kommen und die Menschen, die dort gewesen waren, wurden kollektiv als „Kopenhagener Schule“ bekannt (Maaløe und Kjeldgaard, 1966; Cooper, 2008). Der früheste Befund, auf den sich nachfolgende Arbeiten stützten, war, dass Zellen einer Spezies unterschiedlich schnell wachsen (natürlich in ausgewogenem Wachstum!) unterschieden sich in der Größe je nach Wachstumsrate, wobei die schnelleren größer wurden. Folglich haben Zellen, die in zwei verschiedenen Medien, aber mit der gleichen Wachstumsrate wachsen, die gleiche Zellgröße., Das Kopenhagener Labor war in solchen Studien nicht allein (Schaechter et al., 1958). Umfangreiche Experimente in Bezug auf den RNA-Gehalt zur Wachstumsrate wurden auch von Neidhardt und Magasanik (1960), Neidhardt (1963) und Herbert (1961) berichtet. So wurde ein beträchtliches Fenster zu molekularen Mechanismen geöffnet und Monod wurde bis zu einem gewissen Grad als falsch erwiesen.

Ich sollte erwähnen, dass diese Arbeit durch die Strenge, die Maaløe zu experimentellen Messungen brachte, so weit wie möglich möglich ermöglicht wurde., In seinem Labor wurden lebensfähige Zählungen so genau durchgeführt, dass der experimentelle Fehler konsistent kleiner war als der Zufallsstichprobenfehler (und das war vor dem genauen Pipettieren). Oder, um die Wachstumsrate einer Kultur zu bestimmen, wurden optische Dichtemessungen (Massenmessungen) mindestens 10 Mal im Verlauf jeder Verdoppelung der Kultur durchgeführt. Der tiefere Punkt war jedoch das Streben nach einem quantitativen Ansatz zur Untersuchung des Wachstums.

Warum sollten sich Bakterienzellen derselben Spezies in der Größe unterscheiden?, Bakterien nach Trockengewicht bestehen hauptsächlich aus Proteinen, also könnten schnell wachsende Zellen größer sein, weil sie mehr proteinsynthetisierende Ribosomen enthalten? Als wir den Gehalt an Ribosomen in Zellen, die unterschiedlich schnell wachsen, maßen, stellten wir zu unserer Freude fest, dass es auch hier eine einfache Beziehung gab: Je schneller die Wachstumsrate, desto mehr Ribosomen pro Zellmasse (Ecker und Schaechter, 1963). Mit anderen Worten, die Konzentration der Ribosomen erwies sich als lineare Funktion der Wachstumsrate. Wie beim Testen der Regel bricht diese Beziehung sehr langsam zusammen., Dies ist sinnvoll, da sonst Zellen, die unendlich langsam wachsen, keine Ribosomen hätten und keine Proteine bilden könnten, wenn sie in ein reicheres Medium gelegt würden. Schließlich wurde die Konzentration vieler anderer zellulärer Komponenten als Funktion der Wachstumsrate im Detail bekannt (Bremer und Dennis, 1996). Aufgrund einer solchen Abhängigkeit gehorchen Bakterien der Maxime des spanischen Philosophen José Ortega y Gasset, die ich gerne zitiere: „Ich bin ich und mein Umstand“ (Yo soy yo y mi circunstancia).

Diese Studien befassen sich mit Bakterienpopulationen. Wie wäre es mit einzelnen Zellen?, Ihre Lebensdauer wird durch ihren Zellzyklus beschrieben und unterscheidet sich von der Wachstumskurve. Es hängt stattdessen davon ab, was zwischen einer Division und der nächsten passiert. Welche Ereignisse treten während des Zellzyklus auf? Es wurde frühzeitig mit relativ einfacher Mikroskopie beobachtet und in jüngerer Zeit durch ausgefeiltere Werkzeuge bestätigt, dass die Zunahme der Masse bei wachsenden Bakterien exponentiell ist. Mit anderen Worten, das Wachstum ist auf eine autokatalytische Expansion der meisten Zellkomponenten zurückzuführen., Bestandteile wie Ribosomen und Proteine sind in der Regel in einer großen Anzahl von Kopien vorhanden; Daher müssen sie nicht alle ihre Synthese auf einmal initiieren. Ein Ribosom kann jetzt gemacht werden, ein anderes einen Augenblick später, und doch wird ihre Population insgesamt exponentiell expandieren. Aber die Situation unterscheidet sich für Elemente, die in einer oder einer kleinen Anzahl von Kopien vorhanden sind, bis hin zum Chromosom und der Zelle selbst. Da es sich um einheitliche Ereignisse handelt, müssen beide Prozesse ziemlich genau reguliert werden, damit die Zellpopulation nicht völlig heterogen wird., In den 1950er und frühen 1960er Jahren gab es jedoch nur wenige Werkzeuge, mit denen der Zeitpunkt der DNA-Replikation in einzelnen Zellen untersucht werden konnte. Die Synchronisation einer Kultur konnte nicht ohne weiteres erreicht werden, ohne das normale Wachstum zu stören, z. B. indem die Kultur Temperaturverschiebungen ausgesetzt wurde.

Das früheste Modell zur Regulation des Chromosomenzyklus wurde von Helmstetter et al. (1968), Cooper und Helmstetter (1968) basierend auf einer ausdrücklich nicht intrusiven Methode zur Synchronisierung von Bakterienzellen. Sie nutzten die „Baby-Maschine“, ein Gerät, um unauffällig“ neugeborene “ Zellen zu sammeln., Es war bekannt, dass das Escherichia coli-Chromosom aus einem einzelnen DNA-Molekül besteht und dass seine Replikation an einer Stelle, dem Ursprung, beginnt und an einer anderen, dem Endpunkt, endet. Das H&C-Modell schlug vor, dass das Intervall zwischen Initiierung und Beendigung bei einer gegebenen Temperatur nahezu konstant ist, unabhängig von der Wachstumsrate und dem Reichtum des Mediums. Die Regulierung befasst sich daher hauptsächlich mit der Einleitung, und dies wurde zum Schwerpunkt solcher Studien. In schnell wachsenden Zellen kann die für die Chromosomenreplikation erforderliche Zeit jedoch länger sein als der Zellzyklus., Dies führte zu dem Vorschlag, dass die Initiation nicht auf die Beendigung warten muss, sondern vor Abschluss der vorherigen Replikation stattfinden kann, was zu mehreren gleichzeitigen Replikationsereignissen auf einem Chromosom führt—der sogenannten „Multifork-Replikation“ (Yoshikawa und Sueoka, 1963).

Diese Denkweisen führten zu nachfolgenden Untersuchungen der Mechanismen, die bakterielle Genexpression und Chromosomenreplikation steuern. Wie wird die Synthese der ribosomalen RNAs und Proteine reguliert? Was könnte das mit der Kontrolle der Genexpression zu tun haben? Wie wird die Chromosomenreplikation reguliert?, Und so weiter. Ich habe an dieser Arbeit teilgenommen und freue mich sehr über das ausgeklügelte Verständnis der Mechanismen, die entwirrt wurden. Ich stehe jedoch immer noch in Ehrfurcht vor dem zentralen Wunder-der Fähigkeit solcher scheinbar einfachen Zellen, in einem so perfekten Rhythmus zu wachsen. Ein klares Manifest dieser Perspektive finden Sie im Kommentar von Neidhardt (1999).

Studien zu den Mechanismen, die das Wachstum regulieren, wurden durch genetische Analysen stark unterstützt. Eine große Anzahl bedingter Mutanten, insbesondere von E. coli, wurden konstruiert, z.B. einige hitzeempfindlich (siehe Hirota et al.,, 1968), einige kälteempfindlich (siehe Ingraham, 1969). Die Untersuchung ihres Phänotyps bei den restriktiven Temperaturen ergab viel über die biochemischen Grundlagen für das Wachstum und wurde zu einer wesentlichen Ergänzung der rein physiologischen Experimente.

The Present Day

Obwohl die Kopenhagener Schule schon früh einen quantitativen Ansatz betonte, war das mechanistische Verständnis von Wachstumsphänomenen unbestreitbar begrenzt. Francis Crick hat das so schnell herausgefunden. Als ich ihn 1958 im Cavendish Laboratory der Universität Cambridge besuchte, platzte er heraus: „Herzlichen Glückwunsch!, Ihr habt ein neues Feld begonnen, aber es ist vorbei!“Schluck! Im engeren Sinne galt dies für die Zeit, obwohl ich schon damals schüchtern argumentieren konnte, dass der physiologische Fokus auf die wachsende Zelle einen notwendigen Kontrapunkt zum molekularen Reduktionismus beigetragen hatte. Aber es brauchte Zeit. Jahrhunderts, blieb die Wachstumsphysiologie mehr oder weniger in einem latenten Zustand.

In letzter Zeit hat die mikrobielle Wachstumsphysiologie eine Wiedergeburt in einer Form erlebt, die ein tieferes quantitatives Verständnis von Phänomenen auf einer ganzen Zellebene anstrebt., Dies wird durch das Aufkommen der Systembiologie veranschaulicht: Ein Ansatz, der durch Technologien ermöglicht wird, die kolossale Informationsmengen sammeln und analysieren können, um offen zu legen, wie intrazelluläre Transaktionen zusammenhängen. Tatsächlich habe ich gehört, dass die Systembiologie nur eine allumfassende Sicht der Zellphysiologie ist oder, wenn Sie möchten, eine Fortsetzung der Flucht aus dem biochemischen Reduktionismus. Wie im Laufe der Geschichte wurde die Erforschung der mikrobiellen Physiologie weiterhin von der Entwicklung neuer Methoden der experimentellen und mathematischen Analyse geleitet., Ein paar Beispiele (von vielen) sind in den spannenden Papieren von Edwards et al. (2001), Wang et al. (2010), Valgepea et al. (2013), Klumpp und Hwa (2014) und Scott et al. (2014).

Wie ist die Bakterienwachstumsphysiologie alter mit der Systembiologie von heute verbunden? Sowohl historische als auch konzeptionelle Fäden sind deutlich sichtbar (Schaechter, 2006). Alte Fragen, wie viele makromolekulare Komponenten sich in einer Zelle befinden, wie schnell sie hergestellt werden und wie ihre Wechselwirkungen zum Zellwachstum führen, können nun mit modernen Werkzeugen untersucht werden., Die neueren Methoden haben jedoch immer noch eine direkte Verbindung zu den älteren. Ein Beispiel ist die proteomische Messung von wachsenden versus gestressten E. coli, die erstmals in großem Maßstab in Neidhardts Labor (2011) durchgeführt wurde. Der erste Anstoß für diese Arbeit bestand darin, die Anzahl der Proteine zu bestimmen, die mit unterschiedlichen Wachstumsraten der Kultur hergestellt wurden, was bald darauf abzielte, die Auswirkungen physiologischer Belastungen zu untersuchen., Dieser Ansatz wurde jedoch schnell ersetzt, als diese Forscher feststellten, dass sich solche Studien weitgehend auf das konzentriert hatten, was der Forscher für die Zelle interessant, nützlich oder potenziell lebenswichtig hielt. Bald sahen sie, dass die neuen Methoden zur Untersuchung der globalen Produktion von Proteinen, insbesondere der zweidimensionalen Gelelektrophorese, es dem Forscher ermöglichten, den Ball in den Hof der Mikrobe zu legen und herauszufinden, was die Zelle für wichtig hielt., Viele solcher Untersuchungen der Proteine, die bei unterschiedlichen Wachstumsraten und Temperaturen sowie unter verschiedenen Belastungen durchgeführt wurden, führten zu einer nuancierten Wertschätzung der Zelle als dynamisches System mit einem erweiterten Universum von Regeln und Beziehungen, die ihre Physiologie und ihren Stoffwechsel regeln.

Ein wesentlicher Wert der Systembiologie liegt in ihrer Fähigkeit, Vorhersagemodelle zu erstellen, was in erheblichem Maße mit Hefe erreicht wurde und mit Bakterien realisiert wird. Wir beginnen, eine mehrdimensionale Sicht auf das komplexe Netzwerk von Interaktionen zu erhalten, das zum Wachstum einer Zelle führt., Wie immer muss die experimentelle Grundlage für diese Arbeit darin bestehen, die Zellen unter reproduzierbaren und leicht assayierbaren Bedingungen zu züchten, dh Kulturen in ausgewogenem Wachstum als Grundbedingung zu verwenden. Dies ist nur eines der Konzepte, die die Systembiologie von der Wachstumsphysiologie erbt.

Enfin, Liebhaber eines ausgeglichenen Wachstums, wie ich, werden oft daran erinnert, dass dieser Zustand in der Natur ungewöhnlich ist. Dies ist nicht die Schuld der Zellen., Die meisten planktonischen Zellen und möglicherweise viele sessile Zellen wachsen so schnell, wie es die Bedingungen zulassen (obwohl die reichlich vorhandenen Cyanobakterien im Ozean auf nicht ernährungsphysiologische Induktionen wie ihre Diel-Uhr reagieren). Mikrobielle Umgebungen sind sehr variabel und erlauben in der Regel nur kurze Schübe ungehinderten Wachstums, die auf die Infusion von Lebensmitteln folgen. Ausgewogenes Wachstum über längere Zeiträume findet sich hauptsächlich im Labor. Aber der Experimentator, der Bedingungen bietet, die ein ausgewogenes Wachstum ermöglichen, tut nicht mehr, als Zellen ihre grundlegende Sehnsucht nach Wachstum in die Tat umsetzen zu lassen., Die Zellen kümmern sich um alles andere.

Erklärung zum Interessenkonflikt

Der Autor erklärt, dass die Untersuchung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Acknowledgments

Ich danke Doug Berg, John Ingraham, Fred Neidhardt, Irwin Rubenstein und Christoph Weigel bei der Erstellung dieses Artikels.