Erstellt von Monica Z. Bruckner
Was ist Gram Färbung?
Gram Färbung ist eine gängige Technik verwendet, um zwei große Gruppen von Bakterien auf der Grundlage ihrer verschiedenen Zellwandbestandteile zu unterscheiden. Das Gram-Fleck-Verfahren unterscheidet zwischen grampositiven und gramnegativen Gruppen, indem diese Zellen rot oder violett gefärbt werden., Grampositive Bakterien färben violett aufgrund des Vorhandenseins einer dicken Schicht Peptidoglycan in ihren Zellwänden, die das Kristallviolett zurückhält, mit dem diese Zellen befleckt sind. Alternativ färben gramnegative Bakterien rot, was einer dünneren Peptidoglycanwand zugeschrieben wird, die das Kristallviolett während des Entfärbungsprozesses nicht zurückhält.
Wie funktioniert die Gram-Färbung?
Die Gramfärbung umfasst drei Prozesse: Färben mit einem wasserlöslichen Farbstoff namens Kristallviolett, Entfärbung und Gegenfärbung, normalerweise mit Safanin., Aufgrund von Unterschieden in der Dicke einer Peptidoglycanschicht in der Zellmembran zwischen grampositiven und gramnegativen Bakterien behalten grampositive Bakterien (mit einer dickeren Peptidoglycanschicht) während des Entfärbungsprozesses einen kristallvioletten Fleck, während gramnegative Bakterien den kristallvioletten Fleck verlieren und stattdessen vom Safranin im endgültigen Färbeprozess gefärbt werden. Der Prozess umfasst drei Schritte:
- Zellen werden mit kristallviolettem Farbstoff gefärbt., Als nächstes wird ein Gramm Jodlösung (Jod und Kaliumiodid) hinzugefügt, um einen Komplex zwischen dem Kristallviolett und Jod zu bilden. Dieser Komplex ist ein größeres Molekül als der ursprüngliche kristallviolette Fleck und Jod und ist in Wasser unlöslich.
- Der Probe wird ein Entfärbungsmittel wie Ethylalkohol oder Aceton zugesetzt, das die Peptidoglycanschicht dehydriert, schrumpft und festzieht. Der große Kristallviolett-Jod-Komplex kann diese gestraffte Peptidoglycanschicht nicht durchdringen und ist somit in grampositiven Bakterien in der Zelle eingeschlossen., Umgekehrt wird die äußere Membran gramnegativer Bakterien abgebaut und die dünnere Peptidoglycanschicht gramnegativer Zellen kann den Kristallviolett-Jod-Komplex nicht zurückhalten und die Farbe geht verloren.
- Der Probe wird eine Gegenfarbe, wie das schwach wasserlösliche Safranin, zugesetzt, die sie rot färbt. Da das Safranin heller als Kristallviolett ist, stört es die violette Färbung in grampositiven Zellen nicht. Die entfärbten gramnegativen Zellen sind jedoch rot gefärbt.,
Wie – Färbung Protokoll und Bedenken:
Reagenzien:
- Kristall violett (primäre fleck)
- Jod lösung/Gramm der Jod (beizmittel, dass fixes kristall violett zu zelle wand)
- Entfärbungsmittel (zb ethanol)
- Safranin (sekundäre fleck)
- Wasser (vorzugsweise in eine spritzen flasche)
- Erstellen Sie eine Folie der zu färbenden Zellprobe. Hitze Fixieren Sie die Probe auf dem Objektträger, indem Sie den Objektträger dreimal vorsichtig mit einem Tropfen oder einem kleinen Stück Probe durch einen Bunsenbrenner führen.,
- Fügen Sie den Primärfleck (Kristallviolett) der Probe/Folie hinzu und inkubieren Sie ihn 1 Minute lang. Spülen Sie die Folie maximal 5 Sekunden lang mit einem sanften Wasserstrahl ab, um ungebundenes Kristallviolett zu entfernen.
- Fügen Sie Grams Jod für 1 Minute hinzu-dies ist ein Beizmittel oder ein Mittel, das das Kristallviolett an der Bakterienzellwand fixiert.
- Probe / Objektträger ~3 Sekunden lang mit Aceton oder Alkohol abspülen und mit einem sanften Wasserstrahl abspülen. Der Alkohol entfärbt die Probe, wenn sie gramnegativ ist, und entfernt das Kristallviolett., Wenn der Alkohol jedoch zu lange auf der Probe verbleibt, kann er auch grampositive Zellen entfärben.
- Fügen Sie den sekundären Fleck Safranin dem Objektträger hinzu und inkubieren Sie ihn 1 Minute lang. Mit einem sanften Wasserstrahl maximal 5 Sekunden waschen. Wenn das Bakterium grampositiv ist, behält es den Primärfleck (Kristallviolett) und nimmt den Sekundärfleck (Safranin) nicht auf, wodurch es unter einem Mikroskop violett/violett aussieht. Wenn die Bakterien gramnegativ sind, verliert sie den Primärfleck und nimmt den Sekundärfleck auf, wodurch er unter dem Mikroskop rot erscheint.,