Phenolforbindelser
phenolforbindelser er blandt de mest betydningsfulde drue og en vin bestanddele. De er ansvarlige for alle forskelle i farve og smag mellem røde og hvide vine. De repræsenterer en forskelligartet gruppe af forbindelser, for hvilke der er anvendt en række forskellige klassificeringssystemer.,
Vin phenoler er almindeligvis omtales som “polyfenoler’, skyldes, som det kan ses i Figur 2, at tilstedeværelsen af flere phenol-grupper i deres strukturer, som giver disse forbindelser forskellige egenskaber, der er knyttet til sundhedsmæssige fordele, specielt antioxidant egenskaber, der tilskrives indtagelse af moderate mængder af rødvin. Meget er blevet offentliggjort om dette emne, og området og henvisninger til anmeldelser kan findes i afsnittet ‘Yderligere læsning’.
Figur 2., Struktur af phenolforbindelser. (A) Phenoliske syrer: (i) derivater af o – og p-hydroxybenzoesyre, (ii) derivater af kanelsyre; (B), flavonoider; (C), anthocyaniner; og (D) Tanniner.
Den phenoliske syrer vin (Figur 2A) består hovedsagelig af derivater af benzoic og cinnamic syre. Cinnaminsyrerne esterificeres i vid udstrækning med vinsyre (f.eks. caffeoyltartarsyre eller kaftarsyre), og de danner også acylerede derivater af anthocyaninmonoglycosider (se nedenfor)., Disse forbindelser spiller ikke en væsentlig rolle i vinens organoleptiske egenskaber, selvom kaftarsyre er meget følsom over for O .idation, hvilket gør Mosten eller vinen brun. Bakteriel handling kan føre til omdannelse af kanelsyre derivater (primært s-coumaric og ferulic syrer) i flygtige phenoler såsom ethyl-phenol -, ethyl-gaiacol, eller vinyl gaiacol, der selv i mindre mængder låne intenst ubehageligt aroma og smag til vinen.
flavonoiderne (figur 2B) er gulfarvede pigmenter, der giver den lysegule farve til hvide vine., De er også til stede i røde vine, men deres farve maskeres af anthocyaninerne (figur 2C), farvestofferne i røde vine. Ligesom anthocyaninerne findes flavonoiderne primært som heterosider, hvor 3-positionen på heterocyklen indeholder en sukkerdel. Sidstnævnte kan igen acyleres med kanelsyre, hvilket giver molekylet større stabilitet.
sukkerdelen, som i vinantocyaniner normalt er d-glucose, eller mere sjældent l-rhamnose eller d-galactose, forekommer hovedsageligt i 3-stillingen., Malvidne-3-glucosid er langt den mest rigelige af anthocyaninerne i vin fremstillet af Vitis vinifera Sorter. Det skal bemærkes, at visse hybrid arter af Vitis (Vitis vinifiera×V berlanderi eller V rupestris) indeholder malvidne-3,5-diglucoside og disse arter er ikke tilladt i vine, der er fremstillet eller beregnet til salg i den Europæiske Union på grund af den forhøjede niveauer af methanol, de producerer i løbet af fremstillingen., Tilstedeværelsen af en sådan hybridsort i en vin identificeres ved at bestemme mængden af malvidin-3,5-diglucosid, en analyse, der hurtigt udføres ved tyndtlagskromatografi.
tanniner, der forekommer naturligt i vin er kendt som kondenserede tanniner, polymere strukturer som følge af polymerisering af elementære af phenol og phenolforbindelser, polyhydroxyflavan-3-ols kendt som catechiner (Figur 2D)., Afhængigt af konfigurationen af den chirale kulstofatomer i position 2 og 3 i heterocycle, fire forskellige stereoisomerer er muligt, (+) og (−) catechin og (+) og (−) epicatechin; (+) catechin og (−) epicatechin er de vigtigste byggesten i vin tanniner; disse monomerer hurtigt kondensere til at danne dimerer, trimere, oligomerer, og polymerer i løbet af vinfremstilling og vin-aging. De kondenserer også med anthocyaniner, en proces, der under vinificering er vigtig for stabiliseringen af vinfarve., I modsætning til de flavonoler, pyran ring af flavan-3-oler er mættet og nonplanar og så disse forbindelser har en maksimal UV–synlig absorbans ved 280 nm, som modsætning til ∼370 og 520 nm for flavonoider og anthocyaniner, hhv.
de metoder, der anvendes til bestemmelse af vinphenolforbindelser, er meget forskellige i betragtning af deres forskellige struktur, polaritet, hydrofobicitet og UV-og absorptionskarakteristika for synligt lys. Det er muligt samtidig at adskille størstedelen af de vigtigste ikke-polymeriserede vinphenolforbindelser ved HPLC eller CE., I førstnævnte tilfælde anvendes en omvendt fase kolonne, normalt octadecylcarbon (C18). Hvis den analyse, der er til at omfatte separationer af anthocyaniner, den vandige del af den mobile fase kræver en pH-værdi på <2 (pH-værdier så lave som 1.5 har været anvendt); enten varm eller eddikesyre syrer eller en kombination af begge dele i koncentrationer, der spænder fra 2% til 10%, der anvendes til dette formål. Over pH 2 er alvorlig topudvidelse resultatet af den langsomme interkonvertering mellem de forskellige anthocyaninarter, der fører til dårlig opløsning og dårlige detektionsgrænser., Derudover er anthocyanins spektrale egenskaber dårlige ved pH-værdier større end 2 på grund af omdannelsen af flavyliumkationen til farveløs carbinol-pseudobaseform (figur 3). Dette betyder, at kromatografiske kolonner specielt designet til at modstå ekstreme pH-værdier, der anbefales til denne analyse, udover peak-hale på grund af samspillet mellem hydroxylgrupper af polyphenoler og uomsat silanol grupper på silica overflade er minimeret ved hjælp af base-deaktiveret kolonner., Den organiske komponent i den mobile fase er normalt acetonitril, selvom methanol lejlighedsvis anvendes. For at opnå tilfredsstillende adskillelse af forbindelser med så forskellige polariteter kræves detaljerede binære eller endda ternære gradienter. Analysetiden varierer fra 50 til 120 minutter afhængigt af de nøjagtige driftsforhold og graden af adskillelse, der kræves., Med en kombination af omtanke valgt gradient og UV–synlig fotodiode array afsløring, er det muligt samtidig at analysere tannin monomerer, dimerer, og trimere (λmax 280 nm), fenoliske syrer (λmax ∼330 nm), flavonoider (λmax ∼370 nm), og anthocyaniner (λmax ≈525 nm) i et enkelt løb. Tilstedeværelsen af forskellige kombinationer af disse forbindelser i forskellige koncentrationer kombineret med manglen på mange af standarderne gør imidlertid fortolkningen af kromatogrammerne temmelig vanskelig., Delvist af denne grund, massespektrometri bruges mere og mere ofte som en detektionsmetode til polyphenolanalyse – atmosfærisk tryk-ioniseringsteknikker har en tendens til at være den mest anvendte.
Figur 3. Forskellige former for anthocyaniner.
CE er ikke så udbredt, som LC til analyse af vin polyfenoler., Hvad angår CE-UV-analyse af anthocyaninerne, skal separationer udføres ved meget sure pH ‘ er (på grund af disse forbindelsers dårlige spektrale egenskaber ved neutrale eller basiske pH-værdier), og dette giver problemer med hensyn til metodeselektivitet. CE er på den anden side bedre egnet til ikke-anthocyaninfraktionen af vinpolyfenoler.
som beskrevet tidligere findes en vis fraktion af vinpolyphenoler i kondenserede former (tannin–tannin, anthocyanin–anthocyanin, tannin–anthocyanin), denne fraktion varierer med vinificeringsbetingelserne og øges med vinens alder., Af denne grund forbliver de ovennævnte separationsteknikker relativt begrænsede til analyse af polyphenoler, da kun elementære ikke-polymeriserede molekyler, der spiller en relativt mindre rolle i polyphenolernes overordnede egenskaber, kan bestemmes. For at analysere den kondenserede eller polymeriserede fraktion ved hjælp af en af disse separationsteknikker er det nødvendigt at udføre en thiolyse på forhånd.,
bortset fra specifikke anvendelser kan kravene til rutinemæssig polyphenolanalyse opfyldes tilstrækkeligt ved anvendelse af et antal test, der hurtigt udføres uden behov for detaljeret instrumentering. Det er vanskeligt at bestemme eller udtrykke resultaterne med hensyn til koncentration, så derfor anvendes forskellige indekser, der repræsenterer enten totale polyphenoler eller forskellige grupper af polyphenoliske forbindelser., De test, der kort beskrives nedenfor, er nyttige til at følge udviklingen i en vinificering, til sammenligning mellem forskellige vine og til at søge at kvantificere visse organoleptiske egenskaber ved vin (især bitterhed og astringency).
det samlede polyphenolindeks opnås ved fortynding af vinen og måling af dens absorbans ved 280 nm. Indekset angives som absorbans multipliceret med fortyndingsfaktoren (100 for rødvin)., Denne test tager ikke højde for den farveløse chalcone former af anthocyaniner (Figur 3) eller den phenoliske syrer, der kan absorbere på 230 nm, men disse forbindelser er til stede i så små mængder, at de bidrager meget lidt til den samlede polyfenol indhold.
kaliumpermanganat-indekset er baseret på reduktion af permanganat af polyfenoler ved hjælp af indikatoren carmino indigo farve som varierer mellem blå og gul i henhold til dens oxidationstrin., Det korrekte slutpunkt-når polyfenoler o .ideres, men ikke sukkerarter – er vanskeligt at identificere, og desuden reproducerbarheden af metoden er dårlig mellem operatører.,ines according to their permanganate index (milliequivalents of permanganate used in the titration) as follows:
| Red press wine | 100–150 |
| Tannic red wine | 75 |
| Soft red wine | 60 |
| Rosé wine | 27–35 |
| White wine | 1–15 |
The Folin–Ciocalteu (F–C) index is a more reliable indicator of polyphenol content and is extensively used., Reaktionsblandingen består af phosphotungstic og phosphomolybidic fedtsyrer, hvilket i alkalisk medium, er reduceret med polyphenoler til en blanding af blåt oxider af wolfram og molybdæn, absorbans, som er at læse på 750 nm. F-C-indekset udtrykkes som 100 gange absorptionen af prøven; typiske værdier ligger i området 25-35.
Der er mange kemiske metoder til bestemmelse af det samlede anthocyaninindhold i en vin, hvor de mest enkle er variationer i farven på en vin som en funktion af pH., Ved meget sur pH er anthocyaniner i deres flaviniumkationsform, mens carbinol-pseudobasen (figur 3) under mildt sure betingelser dannes. Vinens absorbans aflæses ved pH 0,6 og pH 3,5, og forskellen i absorbans er empirisk påvist at korrelere med anthocyaninkoncentrationen. Anthocyanin bestemmelse under anvendelse af forskellen i absorbans før og efter tilsætning af en kendt mængde svovldio .id er baseret på det samme princip.,
det er også muligt at fraktionere vinantocyaniner på basis af deres polymerisationsgrad på en håndpakket søjle bestående af polyvinylpolypyrrolidon, silicagel G og silica 60. Den gratis anthocyaniner elueres i den første fraktion (methanol–HCl 999:1), lidt polymeriserede anthocyaniner i den anden fraktion (myresyre–vand 1:1), og condensed polymeriske former elueres i 100% myresyre., Absorbansen for de tre fraktioner aflæses spektrofotometrisk (538 nm for den første fraktion og 525 nm for den anden og tredje fraktion), og deres relative forhold kan således beregnes. Denne test er en meget god indikator for den alder af en vin: den yngre vin, jo højere absorption af den første fraktion på grund af tilstedeværelsen af anthocyanin monomerer, og omvendt, absorbansen af den tredje (polymeriseret) fraktion vil være størst i ældre vine.,
kvantificering af total tanninkoncentration udføres stadig ved metoder baseret på den klassiske Bate–Smith-reaktion: opvarmning i stærkt surt medium fører til dannelse af carbocationer, som i et O .idantmedium danner cyanidin (en anthocyanin). Reaktionsblandingen bliver således rød (deraf det gamle navn for tanninerne – proanthocyanidinerne), og dens absorbans læses ved 550 nm. Senere forbedringer af den oprindelige 1954 metode førte til inkorporering af yderligere foranstaltninger i teknikken., Forskellige empirisk afledte beregninger baseret på absorbansen ved 470, 520, 550 og 570 nm kan give et rimeligt nøjagtigt mål for det samlede tanninindhold i en vin. Disse målinger skelner imidlertid ikke mellem tanninmonomerer, oligomerer eller polymerer. Tanniner producerer en følelse af bitterhed eller astringency på ganen på grund af deres interaktion med prolinrige proteiner og glycoproteiner i spyt., Det tannin molekyler, der er mest aktive i denne henseende, er dem, hvis molekylær masse, der er mellem 600 og 3500; garvesyrer (tanniner) af større molekylær masse, der er for besværligt at få adgang til de aktive steder i de proteiner, og dette forklarer, hvorfor i løbet af vin aldring, som tanniner blive mere polymeriserede indbyrdes eller med anthocyaniner, de synes mindre aggressive til ganen. Til sidst fører denne polymerisering til molekyler, der er tilstrækkeligt store til at udfælde, hvilket forklarer aflejringen, der ofte ses i gamle vine., Dette princip for reaktionen mellem tanniner og proteiner danner grundlaget for en test, kendt som gelatineindekset, for graden af astringency af en vin. En bestemt mængde vin blandes med en opløsning af gelatine (mm 5000-30000) og får lov til at reagere i 3 dage og centrifugeres. Tanninkoncentrationen af vinen før og efter reaktion med gelatine bestemmes som beskrevet ovenfor, og indekset udtrykkes i procentforskellen. Jo højere gelatineindekset er, desto større er koncentrationen af ‘astringerende’ tanniner i vinen., Denne test korrelerer rimeligt godt med graden af astringency opfattet af ekspertsmagere.