Mønstre af cell cycle checkpoint deregulering, der er forbundet med indre molekylære undertyper af human breast cancer celler

decatenation G2 checkpoint er nedsat i LumB brystkræft cellelinjer

for At vurdere, G2/M checkpoint funktion, en MER-analysen benytter to topo II-hæmmere, udstiller forskellige virkningsmekanismer blev ansat til at overvåge G2-M overgangen sats., Cellerne blev inkuberet med colcemid (for at forhindre mitotiske exit) for 2-6 h i tilstedeværelse eller fravær af topo II katalytisk hæmmer ICRF-193 (som ikke åbenlyst skader DNA) til at måle decatenation G2 checkpoint funktion eller topo II gift etoposid (som inducerer DNA-skader) til at måle DNA-skader G2 checkpoint funktion i koncentrationer, der anholdelse 98-100% af normale menneskelige diploide fibroblaster (NHF1-hTERTs) og udødeliggjort lymphoblasts i G2.,36 anvendelsen af colcemid i MER-assayet blokerer celler fra at forlade mitose, hvilket muliggør en streng undersøgelse af G2 til M-overgangen, hvilket minimerer eventuelle forstyrrende virkninger relateret til hastigheden af mitotisk udgang. MER blev beregnet ud fra den lineære del af den resulterende linje (2-6 h-tidspunkter) og udtrykkes som procentdelen af celler, der kommer ind i mitose pr.36

der vises flere eksempler for hmec-cellelinjen R-hmec-e i det venstre panel i Fig 2a., Disse celler, der er akkumuleret i mitose, når inkuberes i colcemid (og køretøjet kontrol dimethylsulfoxid (DMSO), lukkede pladser), der afspejler deres overgang fra G2 til M; men, i overværelse af den katalytiske hæmmer ICRF-193 (åbne cirkler), mitotiske ophobning af R-HMEC-E-celler blev alvorligt hæmmet tyder på, at de fleste af disse celler aktivere en decatenation G2 checkpoint svar., I nærvær af topo II-giftetoposidet blev den mitotiske ophobning af R-hmec-e-celler også alvorligt hæmmet (lukkede trekanter), hvilket indikerer, at denne cellelinie udviser et effektivt DNA-skade G2-kontrolpunkt. Omvendt fortsatte lumbal brystkræftcellelinjen MDA-MB-453 med at akkumulere i mitose i nærvær af ICRF-193, men ikke etoposid (fig. 2a, højre panel), hvilket antyder, at et flertal af disse celler undgik decatenation G2-kontrolpunktet, men blev arresteret i G2 ved DNA-skade.

Alle 24 cellelinjer, der blev udsat for den MER-baseret G2 checkpoint-analysen og gennemsnit af tre uafhængige eksperimenter for hver celle linje (grupperet efter molekylær subtype) er vist i Fig. 2b (gennemsnit individual SEM for individuelle cellelinjer findes i tabel S1)., Som forventet viste alle fire positive kontrol HMEC-cellelinjer alvorlig MER-hæmning som respons på ICRF-193, hvilket tyder på, at denne klasse udviser et effektivt decatenation G2-kontrolpunkt. I modsætning hertil var kontrolpunktsfunktionerne i brystkræftcellelinjerne meget varierende (fig. 2b). Efter gruppering af cellelinjerne efter intrinsic molecular subtype, lumbal-og BL-cellelinjerne syntes at udvise svækket decatenation G2 checkpoint-funktion, hvorimod her2e-og CL-undertyperne viste checkpoint-funktion svarende til HMECs., Et sæt statistiske lineære blandede modeller (LMMs) blev anvendt til at sammenligne G2-kontrolpunktfunktioner mellem de forskellige undertyper (se supplerende oplysninger, (SI)). Disse analyser har dog fastslået, at LumB klasse (men ikke BL klasse) af brystkræft cellelinjer udstillet fejl i decatenation G2 checkpoint funktion (**p < 0.05, FDR < 0.05)., Selv om fordelingen af % hæmning af MER i BL cellelinjer, der i første omgang syntes, der svarer til den LumB gruppe, nærmere inspektion af MER data viste, at BL gruppe udviste meget lav MERs i mangel af en topo II katalytisk-hæmmer, hvilket indikerer, at denne gruppe var ikke svarer til colcemid behandling, således, at den procentvise hæmning af MER vises kunstigt lav i BL-gruppen.,

komplementære eksperimenter blev udført for at vurdere, om brystkræftcellelinjer var i stand til at aktivere DNA-skade G2-kontrolpunktet ved anvendelse af en koncentration af topo II-giftetoposidet svarende til koncentrationen af den katalytiske inhibitor ICRF-193 (4 µM). Alle fire hmec-cellelinjer viste et effektivt DNA-skade G2-kontrolpunkt som respons på etoposid (Fig. 2c)., Størstedelen af bryst cancer cellelinjer også udstillet stort MER hæmning i overværelse af etoposid og ingen signifikante forskelle blev observeret for nogen af brystkræft cellelinjer klasser, således, at disse brystkræft cellelinjer, der var i stand til at aktivere DNA-skader G2 checkpoint på et niveau, der kan sammenlignes med HMECs, med undtagelse af DU4475 LumB cellelinje (Tabel S1).,

for at bekræfte, At ICRF-193 var i stand til at hæmme topo II aktivitet i LumB cellelinjer, cytogenetiske præparater, der blev undersøgt i tilstedeværelse eller fravær af ICRF-193 og repræsentant metafaseceller af to LumB cellelinjer, der er vist i Fig. 2d. i nærværelse af DMSO udviste størstedelen af Lumbemetafaserne individualiserede kondenserede kromosomer. Ved hæmning af topo II med ICRF-193 viste >88% af alle lumbale mitotiske celler kromosomer, der var underkondenserede og/eller sammenfiltrede (data ikke vist)., Således observeret fejl i decatenation G2 checkpoint funktion var usandsynligt, at være resultatet af en fiasko af ICRF-193 til at hæmme topo II katalytisk aktivitet i LumB klasse, der støtter den konklusion, at defekten skyldes, at dysfunktionelle checkpoint aktivering og ikke en manglende evne til LumB klasse til at reagere på ICRF-193 behandling.

tidligere undersøgelser viser, at p53 aktiveres som respons på ICRF-193, og cellelinjer med defekt dekatenering G2-kontrolpunktfunktion udviser svækket aktivering af p53.,36, 37 derfor blev lumbal-og HMEC-klasserne undersøgt for at bestemme, om cellelinjer, der mangler et dekatenation G2-kontrolpunkt, udviser svækket p53-phosphorylering. For at lette sammenligninger på tværs af forskellige blækklatter og konto for eksponering forskelle, de samme NHF1-hTERT prøve blev læsset på hver gel og forøgelsen af aktivering af p-Ser15 p53 for hver celle linje blev normaliseret til NHF1-hTERT interne kontrol. Som vist i det øverste panel i Fig. 2e reagerede alle fire hmec-cellelinjer på ICRF-193 med induktion af total p53 og p-Ser15 p53., Større stigninger i p-Ser15-p53 blev observeret ved etoposid behandling i de fleste af HMEC cellelinjer, der betyder, at aktivering af p53 signalering af ICRF-193 i HMECs svarer til, at der er observeret i andre ikke-tumorigenic cellelinjer.36 i modsætning hertil udviste Lændecellelinjerne svækket induktion af p-Ser15 p53 som respons på ICRF-193 (fig. 2e, nederste panel). Mindst to af disse cellelinjer (HCC1428 og MDA-MB-453) syntes at udtrykke lav eller umålelige niveauer af p53 på trods af husly vildtype TP53 genet.,38 kun MDA-MB-415-cellelinjen udviste en mutantform (Y236C) og høje basale niveauer af p53, hvilket antyder, at p53-aktivering blev svækket af en anden mekanisme end mutation i de fleste af Lændelinjerne. Forøgelsen af p-Ser15 p53 ved etoposidbehandling for Lumbeklassen var ikke statistisk forskellig fra hmec-klassen (fig. S1B), hvilket antyder, at svækket signalering ikke skyldtes tabet af en iboende evne til at phosphorylere Ser15 på p53, men snarere var mindre lydhør over for topo II katalytisk inhibering.,

Aktivering af p-Ser 1981 af ATM-og p-Thr 68 af Chk2 kan bidrage til p-Ser15 aktivering af p53, og er også blevet observeret ved ICRF-193 eksponering;36 imidlertid ingen signifikante forskelle i ATM eller Chk2 aktivering blev observeret i LumB klasse i forhold til den HMEC klasse, sandsynligvis på grund af høje niveauer af variation mellem de cellelinjer (Fig. S1A-B). Vestlige blots af alle cellelinjer, der omfatter de resterende iboende undertyper, er vist i fig. S1C-G., Ingen af de iboende undertyper udviste et statistisk signifikant fald i ATM eller Chk2 sammenlignet med hmec-klassen ved enten ICRF-193 eller etoposid eksponering (fig. S1B); her2e-klassen udviste imidlertid også svækket aktivering af p53 som reaktion på ICRF-193. På grund af den korte eksponeringstid (3 timer) kan dette skyldes den langsommere vækstrate for her2e-linjerne som beskrevet nedenfor. Samlet set indikerer disse resultater, at Lændeklassen har et defekt decatenation G2-kontrolpunkt.,

Brystkræftcellelinjer udviser ændret s/G2/M-cellecyklusprogression

under den indledende G2 / M-kontrolpunkt-skærm udviste flere cellelinjer en lav MER (tabel S1)., Fordi fortolkningen af checkpoint funktion kan blive forvirret af differentierede vækstrater, cell line panel, der blev vurderet til differentieret mønstre af celleproliferation og/eller dereguleret cellecyklus progression kinetik til at redegøre for iboende forskelle i celle cyklus fase længde, der kan blande sig med fortolkning af G2/M checkpoint funktionalitet eksperimenter og til at sikre, at LumB defekt i decatenation G2 checkpoint funktion ikke kan tilskrives iboende forskelle i MER., Sådanne forvirrende virkninger er tidligere rapporteret og skyldes ofte afhængigheden af nogle checkpoint-assays på singulære markører for celleproliferation.36

Tre foranstaltninger af celleproliferation blev sammenlignet via flow-cytometri herunder S fase brøkdel, som bestemmes af EdU inkorporering (S), den mitotiske indeks (MI) som målt ved MPM2+/4N DNA-indhold, og de MER., Antallet af populationsdoblinger (PDL ‘ er), der forekom under kontinuerlig kultur, blev også bestemt ved at tælle det samlede antal celler under hver passage og beregne fordoblingstiden for hver cellelinie (PDL/uge). I Fig. 3 a-d er de individuelle gennemsnit for hver cellelinje afbildet og grupperet efter molekylær subtype. (Gennemsnit for hver cellelinje ± SEM findes i tabel S2).

I Fig. 3a viste s-fasefraktionerne af her2e-og Lumbundertyperne lavere end de andre klasser., LMM-analyse understøttede observationen af et fald i S for her2e-klassen, men faldet i Lændelinjer var ikke statistisk signifikant, hvilket antyder, at HMEC, BL, CL, og Lændeklasser udviser sammenlignelige procentdele af celler, der gennemgår DNA-replikation. I Fig. 3b, BL-cellelinjerne udviste en øget MI sammenlignet med Hmec ‘ erne, og LMM-analyse forstærkede denne observation, hvilket antyder, at hmec -, CL -, LumB-og Her2E-klasserne udviser lignende MIs. I Fig., 3c, MER af BL, CL, og Her2E klasser var lavere end HMEC klasse; disse observationer blev bekræftet af LMM analyse og viser, at kun HMEC og LumB klasser udstillet lignende MERs. I Fig. 3D, PDL-målinger antydede, at lumbal-og her2e-undertyperne har lavere PDL ‘er, og LMM-analyse validerede, at begge klasser udviste signifikant lavere PDL’ er sammenlignet med hmec-klassen., Lændeklassen var sammenlignelig med hmec-klassen ved alle andre målinger af celleproliferation, hvilket indikerer, at en mere sammenligning af hmec-og Lændeklasserne var et passende mål for både dekatenering og DNA-skade G2-kontrolpunktfunktion i Lændecellelinjer. (**p < 0.05, FDR < 0.05)

Fordi afslutningen af DNA-replikation er koblet til starten af mitose, samtidige stigninger i flere foranstaltninger af celleproliferationen (Fig., 3a – C) forventes at forekomme i celler, der opretholder streng regulatorisk kontrol over s/G2/M-cellecyklusprogression for at bevare et diploid genom.39, 40 omvendt ville dette forhold blive forstyrret, hvis cellecyklusfaseovergange blev dereguleret. Således kan de to tilstødende markører af celle-cyklus fase blev evalueret for tilstedeværelse af en forbundne forhold,41 og et fravær af korrelation mellem disse markører vil betyde, at overgangen mellem de to cell cycle faser blev forsinket, og/eller afvigende reguleret.,

HMEC og LumB klasser udstillet et stærkt forbundne forhold mellem S fase fraktion og MI (p < 0.0001 og 0.0041, henholdsvis Tabel 1), hvilket tyder på, at den celle cyklus overgange mellem S/G2/M faser følger en bestilt progression. Men, BL, CL, og Her2E klasser udstillet ingen korrelationsmaalinger forholdet mellem S fase fraktion og MI tyder på, at cellecyklus progression er forsinket eller afvigende, reguleret på et tidspunkt mellem indledningen af DNA-replikation og mitotiske exit., For yderligere at forfine det deregulerede punkt (er) i cellecyklussen blev s-fasefraktion sammenlignet med MER-målingen for at bestemme, om S-eller G2-progression blev forsinket. Kun hmec-klassen (p = 0, 0006) udviste en sammenhæng mellem S og MER; alle brystkræftcellelinjeklasserne viste afkobling af S-fasefraktionen og MER, hvilket antyder, at disse klasser kan tilbringe længere perioder i S-eller G2-faserne eller udvise afvigende cellecykluskontrol under s/G2., Endelig HMEC, LumB, og CL klasser, som alle er udstillet en korrelationsmaalinger forholdet mellem den tid, der er afhængige MER og MI (p = 0.012, p < 0.0001, og for p = 0.0051, henholdsvis) tyder på, at disse klasser opretholde bestilte mitotiske progression. I modsætning hertil viste BL – og Her2E-klasserne ingen signifikant sammenhæng mellem MER og MI, hvilket indikerer, at disse klasser muligvis ikke reagerer på mikrotubulumpolymerisationsinhibitoren colcemid og/eller udviser vanskeligheder med at afslutte mitose. (*p < 0.05, **p < 0.,05, FDR < 0.05)

Kun de ikke-tumorigenic HMEC klasse udstillet en forbundne forhold mellem alle tre spredning markører, hvilket tyder på, at reguleringen af cellecyklus i HMECs er sammen, opstår i et bestilte progression, og illustrerer stramt kontrolleret regulering af S/G2/M progression kinetik i ikke-tumorigenic celler., I modsætning hertil udviste brystkræftcellelinjer deregulering af en eller flere forskellige cellecyklusfaser, hvilket antyder, at s/G2/M-progression blev forsinket eller ændret. BL-og her2e-klasserne viste ingen korrelative forhold, hvilket tyder på, at flere defekter i cellecyklusregulering var til stede. Fordi dataene i Fig. 3a-d demonstrerer, at her2e-klassen også udviste lavere spredningshastigheder i kultur sammenlignet med Hmec ‘ erne, er vi tilbageholdende med at drage konklusioner vedrørende cellecykluskontrolfunktion i cellelinjer i Her2E-klassen uden yderligere data., Sammenfattende antyder disse data, at brystkræftundertyper er forbundet med ændret regulering af S/G2/M-progression, og at BL-og CL-klasserne kan udvise s/G2/M-progressionsdefekter, der undgik påvisning ved MER-assayet.,

CL og BL brystkræft cellelinjer harbor chromatid samhørighed fejl; SAC er nedsat i BL brystkræft cellelinjer

for At afgøre, om de BL og CL klasser udstillet S/G2/M checkpoint mangler, der blev identificeret af MER-skærmen, metafaseceller blev analyseret for at vurdere grov kromosom-struktur afvigelser, som ofte er tegn på checkpoint fejl. Alle metafaser blev scoret på en blind måde, og eksempel spreads er vist i Fig. 4a for en hmec -, BL-og CL-cellelinje., Samlet set udviste metafaser af lumbal-og her2e-klasserne lignende sandsynligheder for at have en samhørighedsdefekt sammenlignet med hmec-klassen (tabel S3A, p = 0.1674 og p = 0.4743). I modsætning hertil syntes CL-og BL-klasserne at udvise en øget sandsynlighed for at huse samhørighedsfejl, der varierede fra mild til svær (fig. 4a).

på Grund af den varierende udvalg af samhørighed defekt sværhedsgrad, metafaseceller blev undersøgt via en høj følsomhed, fluorescens in situ hybridisering (FISH) indhold udnytte en sonde rettet mod centromer af kromosom 9 (CEP9) for at bekræfte tilstedeværelsen af samhørighed fejl og vurdere sværhedsgraden i BL og CL-undervisning., I diploide metafase celler med korrekt cohered søster kromatider, den centromeres af søster kromatider er så tæt sammen, at de ser ud til at være en enkelt CEP9 locus på FISK farvning. Imidlertid, i celler, der udviser samhørighedsdefekter, de centromeriske regioner i søsterchromatiderne adskilles og udviser et dublet-mønster, der indeholder to visuelt adskilte CEP9 loci. Grader af samhørighed defekter blev defineret som mild, moderat,eller svær, 42 og eksempler er vist i Fig. 4b med hvide pile, der angiver hver type samhørighedsdefekt., BL og CL-klasser både udstillet, at stigninger i den samlede procentdel af celler med samhørighed fejl, hvilket tyder på, at disse klasser kan opleve problemer med at gennemføre DNA-replikation og/eller partitionering søster kromatider lige til datterceller. Endvidere var fordelingen af sværhedsgraden af samhørighedsdefekter i begge klasser også forskellig i forhold til Hmec’ erne, hvilket tyder på, at der blev fundet et øget antal moderate/svære samhørighedsdefekter i disse klasser (fig. 4b, nederste panel)., Hertil kommer, at både BL og CL klasser udstillet betydeligt højere procentdele af celler med aneuploidi sammenlignet med HMECs (>4 CEP9 foci per metafase), hvilket tyder på, at samhørighed fejl kan føre til uhensigtsmæssige adskillelse af identiske kromosomer under cytokinese og bekræfter tilstedeværelsen af genomisk ustabilitet i disse klasser (Fig. S2 og tabel S3B).

fordi MERs for CL-og BL-klasserne var lave sammenlignet med hmec-klassen (fig. 3c), tilstedeværelsen af samhørighed defekter (Fig., 4a, B) har tidligere vist sig at aktivere sækken,43 og svær aneuploidi blev observeret i begge klasser (tabel S5B, fig. S2), var det muligt, at BL-og CL-klasserne havde SAC-defekter. Således blev antallet af mitotiske celler, der akkumulerede over en 24 h periode i nærvær/fravær af colcemid, målt ved Flo .cytometri.,19, 44 Denne analyse giver os mulighed for at skelne mellem cellelinjer, der udviser en lav MER på grund af langsom bevægelse gennem S og/eller G2-fasen (betydelige niveauer af mitotiske ophobning i overværelse af colcemid vises over 24 h) og cellelinier, der mangler en funktionel SAC (ingen mitotiske ophobning på grund af en manglende evne til at anholdelse i colcemid). Eksempel flowcytometri profiler for MCF10As (HMEC) og MDA-MB-468s (BL) er vist i det venstre panel i Fig. 4c., Tillæg på 100 ng/mL colcemid dramatisk øget antallet af mitotiske celler i MCF10As, der henviser til, at antallet af mitotiske celler faldt i MDA-MB-468s (Fig. 4c, midterste paneler). Den gennemsnitlige stigning i mitotisk indeks for hver cellelinie grupperet efter intrinsic molecular subtype er vist for tre uafhængige eksperimenter (højre panel, fig. 4c). Individuelle cellelinjegennemsnit findes i tabel S4. Både BL-og her2e-klasserne syntes at udvise en defekt SAC, og LMM-analyse bekræftede, at SAC-funktionen blev reduceret i BL-klassen., Selvom en BL-cellelinie (SUM149) udviste en vis mitotisk akkumulering i nærvær af colcemid, skyldes dette resultat sandsynligvis tilstedeværelsen af en underpopulation af CL-celler fundet i denne cellelinie.34 samlet set antyder disse data, at de kombinerede samhørighedsfejl og afvigende SAC-funktion, der er identificeret i BL-klassen, kan bidrage til de høje niveauer af genomisk ustabilitet, der er observeret i BL-brystkræft., Tilstedeværelsen af en effektiv SAC i CL-klassen antyder, at samhørighedsfejl i disse cellelinjer er i stand til at aktivere SAC, og at den observerede alvorlige aneuploidi sandsynligvis skyldes en alternativ mekanisme for Genomisk ustabilitet. (*p < 0.05, **p < 0.05, FDR < 0.,05)

decatenation G2 checkpoint genekspression signatur korrelerer med de kliniske resultater af brystkræft patienter

for At afgøre, om checkpoint fejl, der er identificeret i den celle online panel, der var forbundet med kliniske resultater, en genekspression underskrift af decatenation G2 checkpoint funktion blev identificeret fra den celle, line panel ved hjælp af kvantitative træk analyse (QTA) (Tabel S5)., 2000 brysttumorprøver, der inkluderer kliniske annotationer, intrinsic molecular subtyping information og genekspressionsdata.45 I en enkelt analyse, decatenation G2 checkpoint signatur var signifikant associeret med en bedre samlet overlevelse i alle brystkræft (HR: 0.7391, CI: 0.5759–0.9486, log-rank p = 0.0176, Fig. 5a). I en multivariat analyse, herunder de iboende molekylære undertyper, var checkpoint signaturen ikke signifikant forbundet med den samlede overlevelse (HR: 0.,76843, CI: 0.5769-1.023, log rank p = 0.071673), men var tæt på signifikant.

decatenation G2 checkpoint signatur var også intelligent af OS resultater i LumA patienter (HR: 0.6039, CI: 0.4559–0.7998, p = 0.01741, Fig. 5b), hvilket tyder på, at nedsat decatenation G2 checkpoint funktion kan bidrage til dårlige resultater i LumA subtype. Median decatenation G2 checkpoint signatur for alle brysttumorer varierede blandt undertyperne (p = 1, 73 e–133, Fig., 5c) med Lumbundertypen, der udtrykker den laveste median kontrolpunktsignatur; denne observation blev uafhængigt verificeret ved hjælp af UNC337–datasættet (p = 8, 46 E-20, tabel S6).27 selvom decatenation G2 checkpoint signatur ikke var signifikant forbundet med resultater inden for lumbal subtype (p = 0.597, tabel S6), kan dette skyldes den iboende lave median decatenation G2 checkpoint signatur inden for denne subtype., For eksempel, hvis størstedelen af Lændetumorer er defekte til dekatenation G2 checkpoint-funktion, er der muligvis ikke tilstrækkelig variation af signaturen inden for Lændeundertypen til at forudsige resultater. Samlet set indebærer disse data, at decatenation G2-kontrolpunktet kan være et klinisk relevant mål for behandling af Luma og/eller lumbal brystkræftpatienter.