Grænser i Bioengineeringand Bioteknologi

Mesenchymal Stromale Celler

Siden beskrevet af Friedenstein (Friedenstein et al., 1966), mesenkymale stamceller/stromalceller (MSC ‘ er) har været fokus for forskningsindsatsen for at udnytte deres terapeutiske potentiale. På grund af deres immun-undvigende karakter frigiver MSC ‘ er immunmodulerende faktorer, som giver dem mulighed for at undslippe afstødningsmekanismer i tilstrækkelig tid til at udøve deres terapeutiske virkning (Ankrum et al.,, 2014). MSC ‘ er udtrykker også en række cytokin-og kemokinreceptorer, såsom C .cr4, C .cr7 og CCR7, hvilket muliggør migration til steder med skade og betændelse (Sasaki et al., 2008; Liu et al., 2012).

som et paradigme for vævsregenerering er MSC ‘ er blevet anvendt til mange ortopædiske tilstande, herunder slidgigt (OA). Den første vellykkede behandling anvendte en gedemodel af OA, der involverede anterior korsbåndstransektion kombineret med total medial meniskektomi (Murphy et al., 2003)., Direkte intraartikulær (IA) levering af autolog knoglemarv (BM)-MSC ‘ er, 6 uger efter skade, førte til menisk reparation og kondro-beskyttelse. Det grønne fluorescerende protein (GFP)-transducerede celler kunne påvises i synovialkapslen, fedtpuden og nydannet menisk, men ikke i ledbrusk. Dette arbejde førte til hypotesen om, at MSC ‘ er virker via alternative mekanismer til celleudskiftning, dvs.trofiske mekanismer til fremme af vævsregenerering gennem modulering af værtsmiljøet og/eller stimulering af endogene forfædre (Jeong et al., 2013)., Undersøgelsen blev efterfølgende valideret i andre prækliniske modeller af OA (Barry and Murphy, 2013). Generelt overføres dette fænomen til andre sygdomsscenarier, som gennemgået omfattende af Prockop et al. (Prockop, 2009). For nylig har fase i-forsøg givet bevis for, at MSC ‘ er også har klinisk anvendelighed til modulering af OA (Jo et al., 2014; Pers et al., 2016); en række upublicerede fase 2-forsøg er i gang med at vurdere adipose-afledte MSC ‘ er i OA, herunder ADIPOA2 (http://adipoa2.eu/).,

MSC ‘ er forsvinder hurtigt fra målvævet efter administration, men er stadig i stand til at levere kondrobeskyttende og immunmodulerende virkninger (ter Huurne et al., 2012). Da deres terapeutiske virkning ser ud til at være uafhængig af deres engraftment, anses den nu for at være hovedsageligt paracrine-medieret. Den stadig mere accepterede model er, at MSC ‘ er findes in vivo som pericytter (Crisan et al., 2008). Disse deltager i udviklingen af væv, herunder synovium, og er involveret i vævsreparation i voksenlivet (Roelofs et al., 2017)., Når den er aktiveret i respons på signaler, der er forbundet med den skadede miljøet, som pro-inflammatoriske cytokiner, et fænomen, der generelt betegnes som “licens,” de udskiller faktorer, herunder kemokiner og cytokiner, at etablere en regenerativ miljø. Afhængigt af miljøet af den specifikke sygdom kan anti-apoptotiske og anti-fibrotiske faktorer begrænse omfanget af skader for at forbedre vævsheling (Ryan et al., 2017). Væv-intrinsic forfædre bliver bedt om at proliferere og differentiere, mens chemoattractants rekruttere endogene forfædre til skadestedet., Samtidigt, aktiveres Kandidater er i stand til at modulere immunresponset lokalt ved selektivt at hæmme spredningen af immunceller (Aggarwal og Pittenger, 2005) (Figur 1). Dette papir vil gennemgå beviserne for disse terapeutiske virkninger i modeller, der er relevante for OA, enten in vivo eller in vitro (opsummeret i tabel 1). Det vil i fremtiden være kritisk at validere disse fund ved hjælp af frisk isolerede stromalceller.

MSC Secretome

MSC ‘ er har en rig sekretorisk profil, som forstærkes af eksponering for inflammatoriske signaler. En proteomics-tilgang identificerede 118 proteiner, der differentielt udtrykkes af humane adipose-afledte stamceller (ASC ‘ er) ved tumornekrosefaktor (TNF)-a-stimulering (Lee et al., 2010)., Disse omfattede mange cytokiner og kemokiner, proteaser og proteasehæmmere, ekstracellulære Matri molecules (ECM) molekyler og faktorer involveret i immunregulering og cellesignalering.

apoptose

Chondrocyte apoptose har været forbundet med degenerativ OA i mange år (Aigner et al., 2004; Del Carlo og Loeser, 2008)., Selv om der er ingen rapporter om direkte anti-apoptotic effekter af it-Kandidater i forbindelse med OA, indirekte beviser, der tyder på, at exosomes hidrøre fra menneskelige Kandidater, og ved slutning består af udskilles faktorer, hæmmet IL-1β-induceret apoptose af ex vivo-kulturperler OA chondrocytter (Liu et al., 2018a). Derudover MSC-afledte exosomes fremmes chondrocyte spredning i et rat model af OA, ved at blokere miR-206 med lncRNA-KLF3-AS1 (Liu et al., 2018b)., På trods af opløselige faktorer, der ikke blev vist i modeller af OA, MSCs reagerede på to forskellige apoptotic cellelinier in vitro ved øget udtryk for og sekretion af anti-apoptotic hormon, stanniocalcin (STC)-1 (Block et al., 2009). Fremtidigt arbejde med at se på fælles tilknyttede MSC-anti-apoptotiske effekter vil sandsynligvis identificere direkte mediatorer af processen.

Fibrose

Maumus et al. co-dyrkede autologe ASC ‘ er med chondrocytter afledt af OA-patienter i et trans .ell-system (Maumus et al., 2013)., Forfatterne observerede markante fald i udtryk niveauer af hypertrofiske og fibrøse markører MMP-13, alkalisk fosfatase, Runx2, collagener type i, III, VI og vimentin, samt en 40% stigning i TGF-β1 sekretion. Ved anvendelse af et neutraliserende antistof blev HGF identificeret som hovedformidleren af den antifibrotiske virkning. Disse data er af særlig relevans, da HGF-koncentration i synovialvæske har en direkte sammenhæng med sværhedsgraden af OA (Dankbar et al., 2007). MSC ‘ er hæmmer også fibrose in vivo gennem bfgf (Suga et al., 2009) og adrenomedullin (Li et al ., 2009)., Derudover foreslog en række undersøgelser, at in vivo-administrerede MSC ‘ er udskilt TSG-6 og indirekte forhindrede fibrose ved at undertrykke den tidlige inflammatoriske respons på forskellige andre sygdomme end OA, herunder myokardieinfarkt (Lee et al., 2009), peritonitis (Choi et al., 2011), betændelse i hornhinden (Oh et al., 2010), og hornhinde allograft afvisning (Oh et al ., 2012).

vævsmetabolisme

blandt andre aktiviteter nedbryder MMP ‘er ECM og reguleres af specifikke hæmmere kaldet timp’ er., I OA forstyrres balancen mellem anabolske og kataboliske faktorer til fordel for sidstnævnte (Lohmander et al., 1993). MMP-2, -9 og -13 blev påvist ved højere niveauer i humant OA-brusk sammenlignet med sundt væv (Jackson et al., 2014). Endvidere korrelerede nedsat MMP-13 med forbedret osteochondral reparation hos rotter behandlet med Do .ycyclin (Lee H. et al ., 2013) og MSC ‘ er udskiller konstitutivt høje niveauer af TIMP-2 og -1, som hæmmer henholdsvis MMP-2 og MMP-9., Under patologisk stress (IL-1,, TNF-α, hypo .i) er TIMP-1-sekretion opreguleret for at modvirke øget katabolisk aktivitet (lo .ito og Tuan, 2011). Derudover er MMP-hæmning ikke specifik; TIMP-1 kan hæmme de fleste MMP ‘er (Visse og Nagase, 2003), hvilket gør MSC’ er til et endnu mere alsidigt værktøj til at genoprette den metaboliske balance i degenererende brusk.

Chondrogenesis

Matricellular proteiner, som udskilles matrix proteiner med regulerende roller, binder sig til ECM og fungerer som receptorer for celle-overflade-molekyler, vækstfaktorer og MMPs (Bornstein et al., 2000)., Trombospondin (TSP2) er for eksempel en kendt regulator for brusk-og knogledifferentiering og udskilles af MSC ‘ er for at inducere proliferation via autokrine mekanismer (Hankenson and Bornstein, 2002). TSP2, udskilt af humant navlestrengsblodafledt (UCB) – MSC ‘ er behandlet med synovialvæske fra OA-patienter, inducerede differentiering af kondroprogenitorceller. Det fremmede bruskregenerering i en kanin i fuld tykkelse osteochondral-defekt model (Jeong et al., 2013)., TSP2 blev fundet at have en autokrin handling på menneskers UCB-Kandidater, BM-Kandidater og ASCs, fremme af brusk differentiering og forebyggelse af hypertrofi (Jeong et al., 2015). Selvom data er begrænset, er der bevis for, at tsp2 er en af de vigtigste paracrine-spillere i MSC-medieret bruskregenerering.

Immunosuppression

Den rolle, betændelse i etablering og vedligeholdelse af OA er nu bredt accepteret (Ayral et al., 2005) med synovial membranbetændelse et kendetegn ved OA-patologi (Goldring, 1999; Pelletier et al., 2001)., Histologiske undersøgelser viser, at OA-patienter have forskellige grader af synovitis, med højere niveauer af pro-inflammatoriske cytokiner og infiltration af immunceller, overvejende makrofager (Benito et al., 2005). Biologiske markører for betændelse korrelerer positivt med knæsmerter (Baker et al., 2010; Scan .ello et al. 2011), og klinisk progression af sygdommen (Krasnokutsky et al., 2011; Roemer et al., 2011)., Licenserede MSC ‘ er udskiller en række antiinflammatoriske cytokiner, som kan hjælpe med at genoprette en ligevægt i det betændte synovium: MSC-konditioneret medium (CM) nedsat produktion af inflammatoriske mediatorer i OA-fælles eksplantater (van Buul et al., 2012).

Di Nicola et al. vurderede først potentialet for allogen MSC-afvisning i en blandet lymfocytreaktion (MLR). I stedet for at fremkalde et immunrespons undertrykte cellerne proliferation af T-celler (Di Nicola et al., 2002; Krampera et al., 2003)., Relevansen af MSC-secernerede faktorer i immunmodulation blev vist ved deres supernatants kapacitet til at aflede immunceller fra skadede organer (Parekkadan et al., 2007). I øjeblikket er MSC ‘ er under evaluering i adskillige kliniske forsøg for mange inflammatoriske tilstande (Trounson og McDonald, 2015).

en af de vigtigste effektorer af MSC-medieret immunsuppression er prostaglandin-E2 (PGE2). PGE2 udskilles konstitutivt af MSC ‘ er, og dets produktion forbedres dramatisk via stimulering af interferon (IFN)-γ, TNF-α (English et al., 2007) eller IL-1 ((Chen et al., 2010)., PGE2 påvirker negativt spredning af T – (Martinet et al., 2009) og naturlige killer (NK) celler (Sotiropoulou et al., 2006), medfører en stigning i den pulje af regulatoriske T (Treg) celler, der stimulerer makrofager til at producere IL-10 og forhindrer monocytter fra differentiering i dendritiske celler (DCs) (Aggarwal og Pittenger, 2005). I OA medierer PGE2 ASC-terapeutiske virkninger og er et regulatorisk kontrolpunkt i immun-modulation. Manfredini et al., fremlagt dokumentation for, at PGE2/COX2 vej er ansvarlig for introduktion af IL-10 og hæmning af TNFa og IL-6 til at fremkalde en M2 skifte i menneskets synovial makrofager (Manferdini et al., 2017).

Indoleamin 2,3-Dio .ygenase (IDO) katalyserer nedbrydningen af tryptophan, hvilket forårsager undertrykkelse af T-celler. Det anvendes af DCs til at modulere immunresponser (Mellor og Munn, 2004), men kan udskilles af MSC ‘ er ved IFN-y-stimulering (Krampera et al., 2006). I en human MLR var IFN-γ-induceret ekspression af IDO i MSC ‘ er ansvarlig for undertrykkelse af T-celleproliferation (Meisel et al., 2004)., Det driver også m2 polarisering i makrofager og inducerer en tolerogen fænotype i DCs og Tregs (Ge et al., 2010; Sica og Mantovani, 2012). Dens betydning for MSC-medieret immunsuppression er blevet valideret ved anvendelse af specifikke hæmmere og knockout MSC ‘ er (Krampera et al., 2006; English Et al., 2007; Spaggiari et al., 2008).

TNF-inducerbart gen (TSG)-6 er kendt for sine flere og forskellige antiinflammatoriske mekanismer (Vilisnie .ski og Vilcek, 2004). Produceret som reaktion på inflammatoriske signaler har den en central rolle i MSC-medieret immunsuppression (Lee et al., 2009)., På den anden side blev det identificeret som et af de mest markant up-regulerede gener i humant OA-ledbrusk (Chou et al., 2015) og foreslået som en sygdomsbiomarkør, da dens aktivitet i synovialvæske forudsagde OA-progression (.isnie .ski et al., 2014). TSG-6 har en kompleks rolle i bruskpatologi, da den er involveret i Matri assemblysamling under syntese af nyt væv (Chou et al., 2018).

apoptotiske MSc ‘ers rolle

Når det er administreret, kan MSC’ er gennemgå biologiske ændringer mere radikale end differentiering eller licens. Toupet et al., observeret, at de fleste MSC ‘er forsvinder 10 dage efter IA-injektion i en murinmodel af OA, med lignende resultater opnået med syngene og .enogene humane ASC’ er (Toupet et al., 2013, 2015). På trods af død og clearance af administrerede celler observeres signifikante terapeutiske virkninger som respons på IA-injektion af museasc ‘ er (ter Huurne et al., 2012; Schelbergen et al., 2014).

apoptotiske celler kommunikerer med immunceller gennem to forskellige mekanismer: direkte effekter forbundet med apoptotiske celler selv og indirekte virkninger udløst i fagocytiserende celler (figur 2)., Direkte effekter inkluderer sekretion af IL-10 og TGF-β, der genererer et immunsuppressivt mikromiljø (Chen et al., 2001; Korns et al., 2011). Dette miljø hæmmer lipopolysaccharid (LPS)-stimulerede makrofager fra udskillelse af IL-1 and og TNF-α (McDonald et al., 1999). Indirekte virkninger er forbundet med eliminering af apoptotiske celler af fagocytter, hvilket resulterer i reduceret respons på LPS (Perruche et al., 2009) og et skifte til en antiinflammatorisk profil (Fadok et al., 1998)., Immunceller, der internaliserer apoptotiske celler, undlader også at inducere CD4 + T-hjælperceller, hvilket efterlader effektorlymfocytterne i en “hjælpeløs” tilstand (Griffith et al., 2007) og inducerer klonal ekspansion af Fo .p3+ Treg-celler (2007ia et al., 2007; Perruche et al., 2008).

anvendelse af en murine model af graft-vs.,-værtssygdom (GVHD), forskere demonstrerede, at infunderet MSC apoptose induceres af modtager-T – celler gennem celle-til-celle-kontakt med frigivelse af perforin-og Gran .yme B-holdige granuler (Galleu et al., 2017). Fagocytter blev også vist at have en nøglerolle, der producerer IDO, når de opsluger apoptotiske MSC ‘ er. Når disse komponenter blev slået ned eller hæmmet, gik den terapeutiske virkning af MSC ‘ er tabt. Vigtigst, infusion af MSC ‘ er gjort apoptotiske e vivo vivo restaureret terapeutiske virkninger. Interessant nok korrelerede patientens lydhørhed over for MSC ‘ er med deres cytotoksiske kapacitet., Disse fund viser, at apoptose er en af drivmekanismen for MSC-medieret immunsuppression.

TGF-β-medieret tolerance induktion er den mest almindeligt rapporterede mekanisme i præ-kliniske undersøgelser af ekstrakorporale photopheresis, administration af leukocytter gjort apoptotic ex vivo. En stærk immunmodulerende virkning blev observeret ved inflammatorisk arthritis (Michle .ska et al., 2009; Perruche et al., 2009) og fotoferese er en godkendt terapi for kutan T-celle lymfom og GvHD (.eit.et al ., 2015)., Apoptose kan også repræsentere en vigtig komponent i MSC-terapi i OA. Upublicerede data i vores laboratorium viser så lavt som 1,6% MSC engraftment 3 dage efter IA administration af GFP+ MSC ‘ er i murine OA knæ. Fluorescerende celler blev ikke påvist i noget tilstødende væv, herunder lokale lymfeknuder. Dette forstærker hypotesen om, at implanterede celler kunne gennemgå apoptose og modulere betændelse med efterfølgende beskyttelse mod OA-udvikling. Mens apoptose efter infusion er en forbigående begivenhed, Galleu et al., viste, at den efterfølgende reaktion kan repræsentere en omprogrammering af visse aspekter værten immunsystemet (Galleu et al., 2017).

se nærmere på: ekstracellulære vesikler

den paracrine virkning af MSC ‘ er er ikke begrænset til opløselige faktorer. MSC ‘ er har ligesom mange andre celler vist sig at producere ekstracellulære vesikler (ECVs) (Lai et al., 2010), små strukturer indesluttet i et phospholipid-dobbeltlag, der bærer mange cytoplasmatiske komponenter., ECV ‘ er er involveret i intercellulær kommunikation gennem vandret overførsel af mRNA og protein og er grupperet baseret på størrelse med forskellig sammensætning og biogenese. E .osomer ligger mellem 40 og 100 nm i diameter. De frigives konstitutivt fra det sene endosomale rum ved fusion af multivesikulære legemer med plasmamembranen, men deres produktion kan stige ved aktivering af cytoskelettet. Eksosomer er kendetegnet ved proteiner, der kræves til deres dannelse og transport, såsom tetraspaniner, Ali.og tumorfølsomhedgen 101., Microvesicles er en heterogen population af ECVs mellem 100 og 1000 nm, der er genereret via direkte spirende ved aktivering af en stress-signal, der ændrer phospholipid balance i den membran, der danner lipid rafts. Mikrovesikler er kendetegnet ved membranmarkører, der er specifikke for modercelletypen. I prækliniske modeller blev ECV ‘ er observeret at have anti-apoptotisk (Bruno et al., 2012), anti-fibrotisk (Li et al ., 2013), pro-angiogen (Bian et al., 2014) og antiinflammatoriske virkninger (Lee et al ., 2012)., MSC-afledte ECV ‘ er inducerer generering af Tregs, hæmmer proliferation af lymfocytter (mokari .adeh et al., 2012), makrofager (2012hang et al ., 2014) og B-celler (Budoni et al ., 2013). Men ECVs alene kan ikke levere de samme immunmodulerende effekter af forældrenes celler, med celle-celle kontakt stadig forpligtet til at modulere lymfocytproliferation og funktion (Conforti et al., 2014).MSC-afledte ECV ‘ er gav lovende resultater i rottemodeller af osteoporose (MSCI et al., 2016) og osteochondral defekt reparation (2016hang et al ., 2016). For nylig blev MSC-ECV ‘ er testet i OA-modeller., Exosomes stammer fra synovium Kandidater og inducerede pluripotente stamceller svækkede sygdom, der scores i en collagenase-induceret OA (CIOA) mus-model, ved at fremme chondrocyte spredning og migration (Zhu et al., 2017). E .osomer afledt af synoviale MSC ‘ er, der overudtrykker miR-140-5p, inducerede proliferation af chondrocytter in vitro. Ved indgivelse i en rottemodel af OA-sygdomsprogression og bruskdegeneration blev signifikant forsinket (Tao et al., 2017). Cosen .a et al. leverede MSC-ECV ‘ er i en CIOA-model og rapporterede reduceret ledskade (Cosen .a et al ., 2017)., Brugen af MSC-ECV ‘ er som terapi for OA ville medføre mange fordele sammenlignet med celleafledte produkter, idet man undgår bekymringer om mulige maligne transformationer. Der kan dog opstå problemer med ECV-produktion, da de muligvis skal skræddersys specifikt til den indikation, der skal behandles. Derudover er deres fremstilling endnu ikke standardiseret til klinisk produktion, som det er tilfældet for cellulære produkter.

konklusioner

rapporter sammenfattet her antyder et betydeligt potentiale for brugen af MSC ‘ er eller MSC-CM i OA., In vitro -, co-kultur OA chondrocytter med ASC-CM resulterede i NF-kB-medieret cytobeskyttende effekter via øget produktion af kollagen II, hæmning af IL-6, TNF og forskellige MMPs, samt opregulering af IL-10 (Platas et al., 2013). På samme måde blev MSC-CM ved anvendelse af OA-bruskeksplantater vist at forstyrre NF-kB-vejen for at formidle antiinflammatoriske og antikataboliske virkninger (van Buul et al ., 2012). MSC ‘ er har allerede vist sig at være et værdifuldt redskab til mange forhold, herunder akut GvHD (Le Blanc et al., 2008) og multipel sklerose (Karussis et al., 2008).,

kliniske fase i-forsøg har vist sikkerheden ved direkte IA-administration af MSC ‘ er hos OA-patienter (Centeno et al., 2008; Davatchi et al., 2011). I 2012, smertereduktion blev rapporteret i op til 6 måneder efter injektion af 20-24 mio MSCs, med øget brusk tykkelse og reduktion af ødematøse subchondral patches i tre ud af seks patienter (Emadedin et al., 2012). Jo et al., injiceres højere doser af ASCs (op til 10 × 108), at opnå markant forbedret WOMAC score med en klinisk meningsfuld smertereduktion og, vigtigst af alt, regenereret hyaline ledbrusken i de mest alvorligt udartede site i knæet (Jo, et al., 2014). I ADIPOA-forsøget forbedrede en enkeltdosis på 2 millioner ASC ‘ er signifikant smerteniveauer og funktion (pers et al., 2016).sammenfattende kan MSC ‘ er virke gennem en hit-and-run-mekanisme snarere end stabilt engrafting i vævet., Obduktioner af patienter, der modtog MSC IV-infusioner til forskellige tilstande inden for et år før døden, bekræfter, at donor-MSC ‘ er normalt ikke opbevares i værtsvævet. Påvisning af donor-DNA korrelerede ikke med graden af HLA-mismatch eller det kliniske respons, hvilket antyder, at clearance ikke er immunmedieret (von Bahr et al., 2012). Celledødens rolle i formidlingen af de terapeutiske virkninger af MSC ‘ er kræver imidlertid yderligere undersøgelse og fænotypen og aktiviteten af celler, der overlever selv i kort tid på implantationsstedet belyst.,

Forfatter Bidrag

PM: bidraget til udviklingen af konceptet understøtter den gennemgang, forsket i den relevante litteratur, og skrev kroppen af revisionen; SR: bidrog også til begrebet om indsendelse og hjulpet med at skrive; AG: forsket i litteraturen om apoptose; JMM: deltog i manuskriptet forberedelse, løbende og afsluttende bedømmelse af indsendelse; FB: deltog også i manuskriptet udformning og revision.

finansiering

PM finansieres af Science Foundation Irland gennem Cramram (Grant no., 13 / RC / 2073) og den irske Blodtransfusionstjeneste. SR er finansieret af et Nui gal .ay Hardiman-stipendium. JMM og FB, som den Europæiske Union (H2020 PHC16-2015, give. 667932; H2020-PHC-2014-2015, give. 643809) og ved Science Foundation Ireland gennem Cúram (Bevilling nr. 13/RC/2073).

Erklæring om interessekonflikt

forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller økonomiske forhold, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

anerkendelser

Vi vil gerne takke Maciek Doc .yk for at designe tallene.,