Grænser i Mikrobiologi

Figur 1. Alfred Hershey (1908-1997). Kilde http://scarc.library.oregonstate.edu/coll/pauling/dna/people/hershey.html.

Figur 2., JAC Jacquesues Monod (1910-1976). Kilde: http://todayinsci.com/2/2_09.htm#MonodJacques.

Jeg vil nævne, at dette arbejde blev gjort muligt, så meget som noget, af den strenghed, Maaløe bragt til eksperimentelle målinger., I hans laboratorium blev levedygtige tællinger udført så præcist, at den eksperimentelle fejl var konsekvent mindre end tilfældig prøveudtagningsfejl (og det var før nøjagtige pipetting gadgets). Eller for at bestemme væksthastigheden for en kultur blev målinger af optisk densitet (masse) foretaget mindst 10 gange i løbet af hver fordobling af kulturen. Men det dybere punkt var et ønske om en kvantitativ tilgang til at studere vækst.

hvorfor ville bakterieceller af samme art afvige i størrelse?, Bakterier efter tørvægt består hovedsageligt af proteiner, så kunne hurtigt voksende celler være større, fordi de indeholder mere proteinsyntetiserende ribosomer? Da vi målte indholdet af ribosomer i celler, der vokser i forskellige hastigheder, fandt vi til vores glæde, at der også var et simpelt forhold her: jo hurtigere vækstrate, jo flere ribosomer pr. Med andre ord viste koncentrationen af ribosomer sig at være en lineær funktion af vækstraten. Som for at teste reglen bryder dette forhold sammen med meget langsomme priser., Dette giver mening, fordi celler, der vokser uendeligt langsomt, ellers ikke ville have ribosomer og ikke ville være i stand til at fremstille proteiner, når de placeres i et rigere medium. Til sidst blev koncentrationen af mange andre cellulære komponenter som en funktion af vækstraten kendt i detaljer (Bremer og Dennis, 1996). På grund af en sådan afhængighed adlyder bakterier Den Spanske filosof Jos.Ortega y Gasset, som jeg er glad for at citere: “jeg er jeg og min omstændighed” (Yo soy yo y mi circunstancia).

disse undersøgelser omhandler bakteriepopulationer. Hvad med enkeltceller?, Deres levetid er beskrevet af deres cellecyklus og adskiller sig fra vækstkurven. Det afhænger i stedet af, hvad der sker mellem en division og den næste. Hvilke begivenheder sker i løbet af cellecyklussen? Det blev observeret tidligt ved hjælp af forholdsvis enkel mikroskopi og bekræftet for nylig af mere sofistikerede værktøjer, at stigningen i masse i voksende bakterier er eksponentiel. Med andre ord skyldes vækst en autokatalytisk udvidelse af de fleste cellekomponenter., Bestanddele som ribosomer og proteiner er normalt til stede i et stort antal kopier; derfor behøver de ikke alle at indlede deres syntese på .n gang. Et ribosom kan laves nu, et andet et øjeblik senere, og alligevel vil deres befolkning samlet set ekspandere eksponentielt. Men situationen adskiller sig for elementer, der er til stede i et eller et lille antal kopier, for at sige kromosomet og selve cellen. At være enhedshændelser skal begge disse processer reguleres ganske præcist, for at cellepopulationen ikke bliver uregelmæssig heterogen., Men i 1950 ‘erne og begyndelsen af 1960’ erne var der få værktøjer til at studere tidspunktet for DNA-replikation i enkeltceller. Division synkronisering af en kultur kunne ikke let opnås uden at forstyrre normal vækst, F.ved at udsætte kulturen for temperaturskift.

den tidligste model til regulering af kromosomcyklussen blev foreslået af Helmstetter et al. (1968), Cooper og Helmstetter (1968) baseret på en udtrykkeligt ikke-påtrængende metode til synkronisering af bakterieceller. De gjorde brug af “baby machine”, en enhed til diskret at indsamle “nyfødte” celler., Det var kendt, at Escherichia coli-kromosomet er sammensat af et enkelt DNA-molekyle, og at dets replikation starter på et sted, oprindelsen og slutter ved et andet, terminalen. H&C-modellen foreslog, at intervallet mellem initiering og afslutning er næsten konstant ved en given temperatur, uanset vækstraten og mediumets rigdom. Regulering drejer sig derfor primært om initiering, og dette blev fokus for sådanne undersøgelser. Men i hurtigt voksende celler kan den tid, der kræves til kromosomreplikation, være længere end cellecyklussen., Dette førte til forslaget om, at indledningen skal ikke vente for opsigelse, men kan finde sted, før den tidligere replikation finish, hvilket fører til flere samtidige replikation begivenheder på et kromosom—den såkaldte “multifork replikation” (Yoshikawa og Sueoka, 1963).

disse måder at tænke på førte til efterfølgende undersøgelser af mekanismerne, der kontrollerer bakteriel genekspression og kromosomreplikation. Hvordan reguleres syntesen af ribosomale RNA ‘ er og proteiner? Hvad kan dette have at gøre med kontrollen af genekspression? Hvordan reguleres kromosomreplikation?, Og så videre. Jeg har deltaget i dette arbejde og får stor glæde af den sofistikerede forståelse af de mekanismer, der er blevet unraveled. Imidlertid, Jeg står stadig i ærefrygt over det centrale vidunder-evnen hos sådanne tilsyneladende enkle celler til at vokse i en så perfekt rytme. For et klart manifest af dette perspektiv, se kommentaren af Neidhardt (1999).

undersøgelser af mekanismerne, der regulerer vækst, blev i høj grad hjulpet af genetisk analyse. Et stort antal betingede mutanter, især af E. coli, blev konstrueret, f.nogle varmefølsomme (se Hirota et al.,, 1968), nogle kolde følsomme (se Ingraham, 1969). At studere deres fænotype ved de restriktive temperaturer afslørede meget om det biokemiske grundlag for vækst og blev et væsentligt supplement til de rent fysiologiske eksperimenter.

den nuværende dag

selv om Københavns Skole understregede en kvantitativ tilgang, var den mekanistiske forståelse af vækstfænomener tidligt i det mindste ubestrideligt begrænset. Francis Crick regnede det ud så forfærdeligt hurtigt. Da jeg besøgte ham på Cavendish Laboratory på Cambridge University i 1958, blæste han ud: “Tillykke!, I startede et nyt felt, men det er forbi!”Gulp! I en snæver forstand var dette sandt for tiden, skønt jeg selv da kunne have frygtet argumenteret for, at det fysiologiske fokus på den voksende celle havde bidraget med et nødvendigt kontrapunkt til molekylær reduktionisme. Men det tog tid. I omkring 50 år, indtil omkring begyndelsen af det 20.århundrede, forblev vækstfysiologi mere eller mindre i latent tilstand.for nylig har mikrobiel vækstfysiologi set en genfødsel i en form, der søger en dybere kvantitativ forståelse af fænomener på et helt celleniveau., Dette eksemplificeres ved fremkomsten af systembiologi: en tilgang muliggjort af teknologier, der kan samle og analysere kolossale mængder information for at afsløre, hvordan intracellulære transaktioner er indbyrdes forbundne. Faktisk har jeg hørt det sagt, at systembiologi kun er et altomfattende syn på cellefysiologi, eller, hvis du ønsker det, en fortsættelse af flugten fra biokemisk reduktionisme. Som det har været tilfældet gennem historien, fortsætter forskningen i mikrobiel fysiologi med udviklingen af nye metoder til eksperimentel og matematisk analyse., Et par eksempler (af mange) kan ses i de spændende artikler af Ed .ards et al. (2001), Wanang et al. (2010), Valgepea et al. (2013), Klump og H .a (2014), og Scott et al. (2014).

hvordan er den gamle bakterievækstfysiologi forbundet med systembiologien i dag? Både historiske og konceptuelle tråde er tydeligt synlige (Schaechter, 2006). Gamle spørgsmål, såsom hvor mange makromolekylære komponenter der er i en celle, hvor hurtigt de fremstilles, og hvordan resulterer deres interaktion i cellevækst, kan nu studeres med moderne værktøjer., Endnu, de nyere metoder har stadig en direkte forbindelse med de ældre. Et eksempel er den proteomiske måling af voksende versus stresset E. coli, først udført i stor skala i Neidhardts laboratorium (2011). Den første impuls for dette arbejde var at bestemme antallet af proteiner fremstillet ved forskellige vækstrater i kulturen, som snart blev rettet mod at se på virkningerne af fysiologiske belastninger., Men denne tilgang blev hurtigt erstattet, da disse forskere indså, at sådanne undersøgelser i vid udstrækning havde været fokuseret på, hvad efterforskeren syntes interessant, nyttig eller potentielt vital for cellen. Snart så de, at de nye metoder til undersøgelse af den globale produktion af proteiner, især todimensionel gelelektroforese, gjorde det muligt for efterforskeren at sætte bolden i mikrobens domstol og opdage, hvad cellen anså for vigtig., Mange sådanne undersøgelser af proteinerne fremstillet ved forskellige vækstrater og temperaturer, såvel som under forskellige belastninger, førte til en nuanceret påskønnelse af cellen som et dynamisk system, med et udvidet univers af regler og forhold, der styrer dets fysiologi og stofskifte.

en stor værdi af systembiologi ligger i dens evne til at skabe forudsigelige modeller, noget der er opnået i betydelig grad med gær og realiseres med bakterier. Vi begynder at få et multidimensionelt billede af det komplekse netværk af interaktioner, der fører til væksten af en celle., Som altid, det eksperimentelle grundlag for dette arbejde skal vokse cellerne under reproducerbare og let assayable betingelser, med andre ord, ved hjælp af kulturer i afbalanceret vækst som baseline tilstand. Dette er kun et af de begreber, som systembiologi arver fra vækstfysiologi.

Enfin, aficionados af afbalanceret vækst, som mig selv, bliver ofte mindet om, at denne tilstand er usædvanlig i naturen. Dette er ikke cellernes skyld., De fleste planktoniske celler og muligvis mange sessile vokser så hurtigt som forholdene tillader det (selvom de rigelige cyanobakterier i havet reagerer på ikke-ernæringsmæssige inducementer, såsom deres diel-ur). Mikrobielle miljøer er meget varierende og tillader normalt kun korte sporer af uhindret vækst, der følger infusionen af mad. Balanceret vækst over langvarige perioder findes hovedsageligt i laboratoriet. Men den eksperimentator, der giver betingelser, der tillader afbalanceret vækst, gør ikke mere end at lade celler iværksætte deres grundlæggende længsel efter at vokse., Cellerne tager sig af alt andet.

Erklæring om interessekonflikt

forfatteren erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller økonomiske forhold, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

anerkendelser

Jeg anerkender taknemmeligt hjælp fra Doug Berg, John Ingraham, Fred Neidhardt, ir .in Rubenstein og Christoph .eigel ved at skrive denne artikel.